1、书 书 书中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌 犅 食 品 安 全 国 家 标 准哺 乳 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 发 布 实 施中 华 人 民 共 和 国国 家 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会发 布书 书 书犌 犅 前 言 本 标 准 代 替 哺 乳 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验。本 标 准 与 相 比，主 要 变 化 如 下：标 准 名 称 修 改 为“食 品 安 全 国 家 标 准哺 乳 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验”；修 改 了 范 围；增 加 了 术 语 和 定 义；修 改 了 试 验 目 的 和
2、原 理；修 改 了 试 验 方 法；修 改 了 数 据 处 理。犌 犅 食 品 安 全 国 家 标 准哺 乳 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 范 围本 标 准 规 定 了 哺 乳 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 的 基 本 试 验 方 法 和 技 术 要 求。本 标 准 适 用 于 评 价 受 试 物 对 哺 乳 动 物 骨 髓 细 胞 的 遗 传 毒 性。术 语 和 定 义 染 色 体 结 构 畸 变通 过 显 微 镜 可 以 直 接 观 察 到 的 发 生 在 细 胞 有 丝 分 裂 中 期 的 染 色 体 结 构 变 化。如 染 色 体 中 间 缺
3、 失 和断 片，染 色 体 互 换 和 内 交 换 等。结 构 畸 变 可 分 为 染 色 体 型 畸 变（）和 染 色 单体 型 畸 变（）。染 色 体 型 畸 变染 色 体 结 构 损 伤，表 现 为 在 两 个 染 色 单 体 的 相 同 位 点 均 出 现 断 裂 或 断 裂 重 组 的 改 变。染 色 单 体 型 畸 变染 色 体 结 构 损 伤，表 现 为 染 色 单 体 断 裂 或 染 色 单 体 断 裂 重 组 的 损 伤。染 色 体 数 目 畸 变染 色 体 数 目 发 生 改 变，不 同 于 正 常 核 型。核 内 复 制在 复 制 的期 之 后，细 胞 核 未 进 行 有
4、 丝 分 裂 就 开 始 了 另 一 个期 的 过 程。其 结 果 是 染 色 体有、倍 的 染 色 单 体。裂 隙染 色 体 或 染 色 单 体 损 伤 的 长 度 小 于 一 个 染 色 单 体 的 宽 度，为 染 色 单 体 的 最 小 错 误 排 列。有 丝 分 裂 指 数中 期 相 细 胞 数 与 所 观 察 的 细 胞 总 数 之 比 值。试 验 目 的 和 原 理在 试 验 动 物 给 予 受 试 物 后，用 中 期 分 裂 相 阻 断 剂（如 秋 水 仙 素 或 秋 水 仙 胺）处 理，抑 制 细 胞 分 裂 时 纺锤 体 的 形 成，以 便 增 加 中 期 分 裂 相 细 胞
5、 的 比 例，随 后 取 材、制 片、染 色、分 析 染 色 体 畸 变。本 试 验 可 检 测 受 试 物 能 否 引 起 整 体 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变，以 评 价 受 试 物 致 突 变 的 可 能 性。若犌 犅 有 证 据 表 明 受 试 物 或 其 代 谢 产 物 不 能 到 达 骨 髓，则 不 适 用 于 本 方 法。仪 器 和 试 剂 仪 器实 验 室 常 用 设 备、恒 温 水 浴 锅（）、离 心 机、生 物 显 微 镜。试 剂 秋 水 仙 素（）：置 于 棕 色 瓶 中，冰 箱 保 存。氯 化 钾 溶 液（）。固 定 液：甲 醇 与 冰 醋 酸 以 混 合
6、，临 用 时 现 配。姬 姆 萨（）储 备 染 液：取 染 料 和 少 量 甲 醇 于 乳 钵 里 仔 细 研 磨，逐 渐 加 入 甲 醇至，待 完 全 溶 解 后，再 加 入 甘 油，混 合 均 匀。置 恒 温 箱 中 保 温。保 温 期 间 振摇 数 次，促 使 染 料 的 充 分 溶 解。取 出 过 滤，室 温 保 存，两 周 后 使 用。应 用 染 液：取份 储 备 染 液 与份 磷 酸 盐 缓 冲 液（）混 合 而 成。临 用时 配 制。磷 酸 盐 缓 冲 液（）。磷 酸 氢 二 钠 溶 液（）：磷 酸 氢 二 钠（）溶 于 去 离 子 水 中。磷 酸 二 氢 钾 溶 液（）：磷 酸
7、 二 氢 钾（）溶 于 去 离 子 水 中。取 磷 酸 氢 二 钠 溶 液（）与 磷 酸 二 氢 钾 溶 液（）混 合。阳 性 对 照 物：常 用 环 磷 酰 胺，丝 裂 霉 素等。试 验 方 法 受 试 物受 试 物 应 使 用 原 始 样 品，若 不 能 使 用 原 始 样 品，应 按 照 受 试 物 处 理 原 则 对 受 试 物 进 行 适 当 处 理。实 验 动 物 动 物 选 择常 用 健 康 年 轻 的 成 年 大 鼠 或 小 鼠，如 使 用 小 鼠，可 选 择周 龄 周 龄，试 验 开 始 时 动 物 体 重 的 差异 不 应 超 过 平 均 体 重 的。动 物 应 随 机 分
8、 组，每 组 雌 性 和 雄 性 动 物 至 少 各只。如 果 试 验 设 有 几 个采 样 时 间 点，则 要 求 每 组 每 个 性 别 每 个 采 样 时 间 点 都 有只 能 用 于 分 析 的 动 物。动 物 准 备试 验 前 动 物 在 实 验 动 物 房 至 少 应 进 行 环 境 适 应 和 检 疫 观 察。动 物 饲 养实 验 动 物 饲 养 条 件 应 符 合、饮 用 水 应 符 合、饲 料 应 符 合 的 有 关 规 定。试 验 期 间 动 物 自 由 饮 水 和 摄 食，每 笼 动 物 数 应 满 足 实 验 动 物 最 低 需 要 的 空 间，以 不 影 响 动 物
9、自 由 活 动 和观 察 动 物 的 体 征 为 宜。犌 犅 剂 量应 进 行 预 试 验 以 选 择 最 高 剂 量。如 果 受 试 物 具 有 毒 性，应 设个 剂 量，最 高 剂 量 组 原 则 上 为 动 物 出现 严 重 中 毒 表 现 和（或）个 别 动 物 出 现 死 亡 的 剂 量，一 般 可 取，低 剂 量 组 应 不 表 现 出 毒 性，分 别取 和 作 为 中、低 剂 量。对 于 在 低 或 无 毒 剂 量 下 具 有 特 异 生 物 学 活 性 的 物 质（如 激 素和 丝 裂 源）可 以 抑 制 骨 髓 细 胞 有 丝 分 裂 指 数（以 上）为 指 标 确 定 最
10、高 剂 量，按 等 比 级 数向 下 设 置中、低 剂 量 组。急 性 毒 性 试 验 给 予 受 试 物 最 大 剂 量（最 大 使 用 浓 度 和 最 大 灌 胃 容 量）动 物 无 死 亡 而 求 不出，并 且 根 据 结 构 相 关 物 质 资 料 不 能 推 断 受 试 物 具 有 遗 传 毒 性 时，则 不 必 设个 剂 量。按 以 下 顺序 只 设 一 个 剂 量：）体 重；）人 的 可 能 摄 入 量 的 倍；）一 次 最 大 灌 胃 剂 量，连 续 染 毒。另 设 溶 媒 对 照 组 和 阳 性 对 照 组，如 果 没 有 文 献 资 料 或 历 史性 资 料 证 实 所 用
11、 溶 媒 不 具 有 有 害 作 用 或 致 突 变 作 用，还 应 设 空 白 对 照 组。阳 性 对 照 物 可 用 丝裂 霉 素（体 重 体 重）或 环 磷 酰 胺（体 重）经 口 或 腹 腔 注 射给 予。试 验 步 骤 给 予 受 试 物 方 式经 口 给 予 受 试 物，受 试 物 溶 液 一 次 灌 胃 量 不 应 超 过 体 重。采 用 一 次 染 毒 或 多 次 染 毒 方式。一 次 染 毒 应 分 两 次 采 集 标 本，即 每 组 动 物 分 两 个 亚 组，亚 组于 染 毒 后 处 死 动 物 采 集第 一 次 标 本，亚 组于 亚 组动 物 处 死 后 采 集 第 二
12、 次 标 本。如 果 采 用 多 次 染 毒 方 式，可 给 予 受 试物次 次，每 次 间 隔，在 末 次 染 毒 后 采 集 一 次 标 本。处 死 动 物 前，按 体 重 腹 腔 注 射 秋 水 仙 素。取 材颈 椎 脱 臼 法 处 死 动 物，迅 速 取 出 股 骨，剔 去 肌 肉，擦 净 血 污，剪 去 两 端 骨 骺，用 带 针 头 的 注 射 器 吸 取 生 理 盐 水，插 入 骨 髓 腔，将 骨 髓 洗 入 离 心 管，然 后 用 吸 管 吹 打 骨 髓 团 块 使 其 均 匀，将 细 胞 悬液 以 离 心，弃 去 上 清 液。低 渗离 心 后 的 沉 淀 物 加 入 氯 化
13、钾 溶 液，用 滴 管 将 细 胞 轻 轻 吹 打 均 匀，放 入 水 浴中 低 渗。预 固 定立 即 加 入 固 定 液（甲 醇冰 醋 酸），以 离 心，弃 去 上 清 液。固 定加 入 固 定 液，混 匀，固 定 后，以 离 心，弃 去 上 清 液，用 同 法 再 加 固定 液次 次，弃 去 上 清 液。滴 片加 入 数 滴 新 鲜 固 定 液，用 滴 管 充 分 混 匀。将 细 胞 悬 液 均 匀 的 滴 于 冰 水 玻 片 上，轻 吹 细 胞 悬 液 扩 散 平犌 犅 铺 于 玻 片 上。每 个 标 本 制张 张 玻 片，空 气 中 自 然 干 燥。染 色用 染 液 染 色，去 离 子
14、 水 冲 洗，空 气 中 自 然 干 燥。阅 片在 低 倍 镜 下 检 查 制 片 质 量，制 片 应 为 全 部 染 色 体 较 集 中，而 各 个 染 色 体 分 散、互 不 重 叠、长 短 收 缩 适中、两 条 单 体 分 开、清 楚 地 显 示 出 着 丝 点 位 置、染 色 体 呈 红 紫 色。用 油 镜 进 行 细 胞 中 期 染 色 体 分 析，每 只动 物 分 析 个 中 期 相 细 胞，每 个 剂 量 组 不 少 于 个 中 期 分 裂 相 细 胞。在 读 片 时 应 记 录 每 个 观 察细 胞 的 染 色 体 数 目，对 于 畸 变 细 胞 还 应 记 录 显 微 镜 视
15、 野 的 坐 标 位 置 及 畸 变 类 型。由 于 低 渗 等 机 械 作 用的 破 坏，会 导 致 处 于 中 期 的 染 色 体 发 生 丢 失，所 以，观 察 的 中 期 相 染 色 体 数 目 应 控 制 在 狀 内。观 察 指 标 染 色 体 数 目 的 改 变 非 整 倍 体：亚 二 倍 体 或 超 二 倍 体。多 倍 体：染 色 体 成 倍 增 加。核 内 复 制：核 膜 内 的 特 殊 形 式 的 多 倍 化 现 象。染 色 体 结 构 的 改 变 断 裂：损 伤 长 度 大 于 染 色 体 的 宽 度。微 小 体：较 断 片 小 而 呈 圆 形。有 着 丝 点 环：带 有
16、着 丝 点 部 分，两 端 形 成 环 状 结 构 并 伴 有 一 双 无 着 丝 点 断 片。无 着 丝 点 环：成 环 状 结 构。单 体 互 换：形 成 三 辐 体、四 辐 体 或 多 种 形 状 的 图 像。双 微 小 体：成 对 的 染 色 质 小 体。裂 隙：损 伤 的 长 度 小 于 染 色 单 体 的 宽 度。非 特 定 性 型 变 化：如 粉 碎 化、着 丝 点 细 长 化、黏 着 等。数 据 处 理 和 结 果 评 价 数 据 处 理每 只 实 验 动 物 作 为 一 个 观 察 单 位，每 组 动 物 按 性 别 分 别 计 算 染 色 体 结 构 畸 变 细 胞 百 分
17、 率。若 雌、雄动 物 之 间 无 明 显 的 性 别 差 异，可 合 并 计 算 结 果。可 用 检 验 方 法 进 行 统 计 学 分 析。裂 隙 应 单 独 记 录 和报 告，但 一 般 不 计 入 总 的 畸 变 率。结 果 评 价结 果 评 价 时 应 从 生 物 学 意 义 和 统 计 学 意 义 两 个 方 面 进 行 分 析。剂 量 组 染 色 体 畸 变 率 与 阴 性 对 照 组相 比，具 有 统 计 学 意 义，并 呈 剂 量反 应 关 系 或 一 个 剂 量 组 出 现 染 色 体 畸 变 细 胞 数 明 显 增 高 并 具 有 统 计学 意 义，并 经 重 复 试 验
18、 证 实，即 可 确 认 为 阳 性 结 果。若 有 统 计 学 意 义，但 无 剂 量反 应 关 系 时，则 应 进 行重 复 试 验。结 果 能 重 复 者 可 确 定 为 阳 性。犌 犅 试 验 报 告 试 验 名 称、试 验 单 位 名 称 和 联 系 方 式、报 告 编 号。试 验 委 托 单 位 名 称 和 联 系 方 式、样 品 受 理 日 期。试 验 开 始 和 结 束 日 期、试 验 项 目 负 责 人、试 验 单 位 技 术 负 责 人 或 授 权 签 字 人、签 发 日 期。试 验 摘 要。受 试 物：名 称、批 号、剂 型、性 状（包 括 感 官、性 状、包 装 完 整
19、 性、标 识）、数 量、前 处 理 方 法、溶 媒。实 验 动 物：物 种、品 系、级 别、数 量、体 重、性 别、来 源（供 应 商 名 称、实 验 动 物 生 产 许 可 证 号），动 物 检疫、适 应 情 况，饲 养 环 境（温 度、相 对 湿 度、实 验 动 物 设 施 使 用 许 可 证 号），饲 料 来 源（供 应 商 名 称、实 验 动物 饲 料 生 产 许 可 证 号）。试 验 方 法：分 组、每 组 动 物 数、剂 量 选 择 依 据、受 试 物 给 予 途 径 及 期 限、观 察 指 标、统 计 学 方 法。试 验 结 果：以 文 字 描 述 和 表 格 逐 项 进 行 汇 总，包 括 观 察 和 分 析 的 细 胞 数、染 色 体 畸 变 类 型 和 数 量 及畸 变 率，给 出 数 据 的 统 计 处 理 结 果。试 验 结 论：给 出 明 确 结 论。试 验 的 解 释阳 性 结 果 表 明 受 试 物 具 有 引 起 受 试 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变 的 作 用。阴 性 结 果 表 明 在 本 试 验 条 件 下 受 试 物 不 引 起 受 试 动 物 骨 髓 细 胞 染 色 体 畸 变。
