1、 GB 31660.1 2019 2019-09-06 发布 2020-04-01 实施 食 品 安全国 家 标准 水 产 品中大 环 内酯类 药 物残留 量 的测定 液 相 色谱-串 联 质谱法 National food safety standard-Determination of macrolides residues in fishery products by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method 发布 GB31660.1 2019 I 前 言 本标准 系首 次发 布。GB31660.1 2019 1 食品安
2、 全国家标准 水产品 中大环内酯类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准 规定 了水 产品 中竹 桃霉素、红霉 素、克 拉霉 素、阿 奇霉 素、吉 他霉 素、交 沙霉素、螺旋霉 素、替米 考星、泰乐 菌素9 种大 环内 酯类 药物 残 留量检 测的 制样 和液 相色 谱-串 联质 谱测定方 法。本标准 适用 于水 产品 中鱼、虾、蟹、贝类 等的 可食 组 织中竹 桃霉 素、红 霉素、克 拉霉素、阿奇霉 素、吉 他霉素、交 沙霉素、螺旋 霉素、替米 考星、泰乐菌 素9种大 环内 酯类药 物残留量的检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少
3、的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本适用于 本文 件。凡是 不注 日 期的引 用文 件，其最 新版 本（包括 所有 的修 改单）适用 于本文 件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 3 原理 试样中 大环 内酯 类药 物 的 残留 经 乙腈 提取，正 己烷 除脂、中 性氧 化铝柱 净化，液 相色 谱-串联 质谱 法测 定，外标 法 定量。4 试剂与 材料 除另有 规定 外，所有 试剂 均为分 析纯，水 为符 合GB/T 6682 规 定的 一级 水。4.1 试剂 4.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。4.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.1
4、.3 正己 烷（C6H14）：色谱纯。4.1.4 甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.1.5 乙酸 铵（CH3COONH4）。4.1.6 异丙 醇（CH3）2CHOH。4.2 溶液配 制 4.2.1 乙腈饱 和正 己烷：取 正己 烷 200 mL 于 250 mL 分液漏斗中，加 入适 量乙 腈后，剧烈 振摇，待分 配平 衡后，弃 去乙腈 层即 得。GB31660.1 2019 2 4.2.2 0.05 mol/L 乙酸铵溶 液：取 乙酸 铵 0.77 g，用 水溶解 并稀 释 至 200 mL。4.2.3 0.1%甲酸 溶液：取 甲酸 1 mL，用水溶解 并稀 释至 1 000 mL。4.2.4
5、 定容 液：取乙 腈 20 mL 和乙酸铵溶 液 80 mL，混合均 匀。4.3 标准品 竹桃霉 素、红霉 素、克 拉 霉素、阿奇 霉素、交沙 霉 素、螺 旋霉 素、替 米考 星、泰乐 菌素 含量均 92.0%，吉他 霉素 含量 72.0%，具 体见 附 件 A。4.4 标准溶 液制 备 4.4.1 标准 贮备 液：取竹 桃霉素、红 霉素、克拉 霉 素、阿 奇霉 素、吉 他霉 素、交沙 霉素、螺旋霉素、替 米考 星 和 泰乐 菌素 标 准品 各 适 量（相当 于各活 性成 分 约 10 mg），精密称 定，分别 于 100 mL 棕色量瓶中，用甲醇 溶解 并稀 释至 刻度，配 制成 浓度 为
6、100 g/mL 大环内酯类药物标 准贮 备液。红霉 素、克拉霉 素和 泰乐 菌素-20 以下避 光保 存，竹 桃霉 素、阿奇霉 素、吉他霉 素、交沙 霉素、螺 旋霉素、替 米考 星 4 以 下避光 保存，有 效 期 3 个 月。4.4.2 混合 标准 工作 液：精密量 取标 准贮 备液 各 1 mL，于 10 mL 棕色量瓶中，用甲 醇溶 解并稀释 至刻 度，配 制成 浓度 为 10 g/mL 大环内酯 类药 物混合 标 准 工作 液。4 以 下避光 保存，有效 期 1 个 月。4.5 材料 4.5.1 中性 氧化 铝固 相萃 取 柱：2g/6mL，或相当者。4.5.2 尼龙 微孔 滤膜：0
7、.22 m。5 仪器和 设备 5.1 液相色 谱-串联 质谱 仪：配 电喷雾 离子 源。5.2 分析天 平：感量 0.000 01 g 和 0.01g。5.3 氮吹仪。5.4 旋涡混 合器：3 000 r/min。5.5 移液枪：200 L，1 mL，5 mL。5.6 离心机：4 000 r/min。5.7 梨形瓶：100 mL。5.8 超声波 振荡 器。5.9 旋转蒸 发器。6 试料的 制备 与保 存 6.1 试料的 制备 取适量 新鲜 或解 冻的 空白 或供试 组织，绞 碎，并使 均质。GB31660.1 2019 3 取 均质 后的 供试 样品，作为 供试 试料。取 均质 后的 空白 样
8、品，作为 空白 试料。取 均质 后的 空白 样品，添加 适宜 浓度 的标 准工 作液，作为 空白 添加 试料。6.2 试料的 保存-18 以下保 存，3个 月内 进行分 析检 测。7 测定步 骤 7.1 提取 取试料5g（准 确至 20mg），于50 mL 塑料离心管，加入乙 腈20 mL，于旋涡 混 合器上以2 000 r/min 旋涡1 min，超声5 min，以3 500 r/min 离心6 min，取上清 液转 移 至另一 离心 管中，残 渣再 加乙 腈15 mL，重复提 取一 次，合并 上清 液，备 用。7.2 净化 中性氧 化铝 固相 萃取 柱预 先用乙 腈5 mL 活化，取备 用
9、液过 柱，用乙 腈5 mL 洗 脱，收 集洗脱 液 于梨 形瓶 中，加入 异丙醇4 mL，40旋 转蒸 发至干。精密 加 入定 容液2 mL 溶解残余物，加 乙腈 饱和 正己 烷2 mL，转至10 mL 离心管中，旋涡10 s，以3 000 r/min 离心8 min，取下层清 液过0.22 m 滤膜，供液相 色谱-串联 质谱 测定。7.3 基质匹 配标 准曲 线的 制备 精密量 取混 合标 准工 作液 适量，用空 白样 品提 取液 溶解稀 释，配制 成大 环内 酯类药 物浓度为1 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL 和1
10、000 ng/mL 的系列基质 标准 工作 溶液；现 配现用。以特 征离子 质量 色谱峰 面积 为纵 坐标，标 准溶液 浓度 为 横坐标，绘制 标准 曲线。求 回归方 程和 相关 系数。7.4 测定 7.4.1 液相 色谱 参考 条件 a）色 谱柱：C18色 谱柱（150 mm 2.0 mm，5 m）或相当 者；b）流 动相：A：0.1%的 甲 酸水溶 液，B：乙 腈，梯度 洗脱程 序见 表1；c）流 速：0.2 mL/min；d）柱 温：30；e）进 样量：10 L。表1 流动相 梯度 洗脱 条件 时间，min 0.1%甲酸水溶液，%乙腈，%0 95 5 2 95 5 10 5 95 11
11、95 5 16 95 5 7.4.2 质谱 参考 条件 GB31660.1 2019 4 a）离 子源：电 喷雾（ESI）离子 源；b）扫 描方 式：正离 子扫 描；c）检 测方 式：多反 应监 测；d）喷 雾电 压：4 000 V；e）离 子传 输毛 细管 温度：350；f）雾化 气压 力：248 KPa；g）辅 助气 压力：48 KPa；h）定 性离 子对、定 量离 子 对和碰 撞能 量见 表2。表2 定性离 子对、定 量子 离子 和碰撞 能量 化合物名称 定性离子对及碰撞能量，eV 定量离子对及碰撞能量，eV 竹桃霉素（OLD）688.4/158.1（28）688.4/544.3（16）
12、688.4/544.3（16）红霉素（ERM）734.4/158.2（28）734.4/576.2（18）734.4/576.2（18）克拉霉素（CLA）748.5/158.1（28）748.5/590.4（18）748.5/158.1（28）阿奇霉素（AZI）749.5/158.0（36）749.5/591.4（27）749.5/158.0（36）吉他霉素（KIT）772.4/109.4（33）772.4/174.3（30）772.4/174.3（30）交沙霉素（JOS）828.3/109.4（35）828.3/174.1（32）828.3/174.1（32）螺旋霉素（SPI）843.4/1
13、74.2（36）843.4/142.1（40）843.4/174.2（36）替米考星（TIL）869.5/137.7（41）869.5/696.3（36）869.5/696.3（36）泰乐菌素（TYL）916.4/174.2（36）916.4/772.2（29）916.4/174.2（36）7.4.3 测定 法 a）定性 测定 在同样测 试条 件下，试样 溶 液中大 环内 酯类药 物的 保留时间 与标 准工作 液中 大环内 酯类药物的保留时间之比，偏差在 5%以内，且检测 到的离子的相对丰度，应 当与浓度相当的校正 标准 溶液 相对 丰度 一致。其允 许偏 差应 符合 表 3 要 求。表3 定
14、性确 证时 相对 离子 丰度 的允许 偏差 相对离子丰度，%允许偏差，%50 20 2050 25 1020 30 10 50 b）定 量测 定 GB31660.1 2019 5 按7.4.1 和7.4.2 设定 仪器条 件，以基 质标 准工作 溶液 浓度为横 坐标，以峰 面积 为纵坐标，绘制标 准工 作曲 线，作单 点或多 点校 准，按外 标法 计算试 样中 药物 的残 留量，定 量离 子采 用丰度最 大的 二级 特征 离子 碎片。标准 溶液 特征 离子 质量 色 谱图 参见 附录B。7.5 空白试 验 除不加 试料 外，均按 上述 测定步 骤进 行。8 结果计 算和 表述 试样中 待测 药
15、物 的残 留量 按式（1）计算：m AV A CXss（1）式中：X 试样 中被 测组 分的 残 留量，单位 为微 克每 千克（g/kg）；CS 标 准工 作液 测得 的被 测组分 溶液 浓度，单 位为 纳克每 毫升（ng/mL）；A 试样 溶液 中被测 组分 峰 面积；As 标准 工作 液被 测组 分 峰面积；V 试样 溶液 定容体 积，单 位为毫 升（mL）；m 试 料质 量，单位为 克（g）。计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9 方法灵 敏度、准 确度 和精 密度 9.1 灵敏度 本方法 的检 测限 为1.0 g/kg；红霉 素、替 米考星
16、定量 限为2.0 g/kg，竹 桃霉 素、克 拉霉素、阿 奇霉 素、吉他 霉素、交沙 霉素、螺 旋霉 素、泰乐菌 素定 量限 为4.0 g/kg。9.2 准确度 红霉素、替 米考 星在2.0 40 g/kg 添加 浓度 的回 收率 为70%120%；竹 桃霉 素、克拉 霉素、阿奇 霉素、吉他霉 素、交 沙霉 素、螺 旋霉素、泰乐菌 素在4.0 40 g/kg 添加浓 度的 回收率为70%120%。9.3 精密度 本方法 的批 内相 对标 准偏 差 15%，批间 相对 标准 偏差 15%。GB31660.1 2019 6 附录A（资料性附录）药物中英文通用名称、化 学分子式 和CAS 号 表 A
17、.1 9 种大环内酯类 药物中英文通用名称、化 学分子式和 CAS 号 中文通用名称 英文通用名称 化学分子式 CAS 号 竹桃霉素 Oleandomycin C35H61NO12 2751-09-9 红霉素 Erythromycin/110-07-8 克拉霉素 Clarithromycin C38H69NO13 81103-11-9 阿奇霉素 Azithromycin C38H72N2O12 83905-01-5 吉他霉素 Kitasamycin/69-23-8 交沙霉素 Josamycin C42H69NO15 16846-24-5 螺旋霉素 Spiramycin C43H74N2O14 8025-81-8 替米考星 Tilmicosin C46H80N2O13 108050-54-0 泰乐菌素 Tylosin C46H77NO17 1401-69-0 GB31660.1 2019 7 A A 附录B（资料性附录）标准溶液特征离子质量 色 谱图 图 B.1 混合标准溶液的特征离子质量 色谱图（1.竹桃霉素 1ng/mL 2.红霉素 1ng/mL 3.克拉霉素 1ng/mL 4.阿奇霉素 1ng/mL 5.吉他霉素 1ng/mL 6.交沙霉素 1ng/mL 7.螺旋霉素 1ng/mL 8.替米考星 1ng/mL 9.泰乐菌素 1ng/mL）_
