1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B 5 0 0 9.2 42 0 1 6食 品 安 全 国 家 标 准食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M族 的 测 定2 0 1 6-1 2-2 3发 布2 0 1 7-0 6-2 3实 施中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B 5 0 0 9.2 42 0 1 6 前 言 本 标 准 代 替GB5413.372010 食 品 安 全 国 家 标 准 乳 和 乳 制 品 中 黄 曲 霉 毒 素M1的 测 定、GB5009.242010 食 品 安 全 国 家
2、 标 准 食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M1和B 1的 测 定、GB/T232122008 牛奶 和 奶 粉 中 黄 曲 霉 毒 素B 1、B 2、G1、G2、M1、M2的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法-荧 光 检 测 法 和SN/T16642005 牛 奶 和 奶 粉 中 黄 曲 霉 毒 素M1、B 1、B 2、G1、G2含 量 的 测 定。本 标 准 与GB5413.372010相 比,主 要 变 化 如 下:标 准 名 称 修 改 为“食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M族 的 测 定”;增 加 了 方 法 适 用 范 围;增 加 了 对 黄 曲 霉 毒
3、 素M2的 检 测;修 改 了 酶 联 免 疫 法,并 修 改 第 三 法 名 称 为 酶 联 免 疫 吸 附 筛 查 法;修 改 了 液 相 色 谱-质 谱 联 用 法;修 改 了 液 相 色 谱 法 的 前 处 理 方 法;删 除 了 免 疫 层 析 净 化 荧 光 分 光 度 法。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 61 食 品 安 全 国 家 标 准食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M族 的 测 定1 范 围本 标 准 规 定 了 食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M1和 黄 曲 霉 毒 素M2(以 下 简 称AFTM1和AFTM2)的 测 定方 法。第 一 法 为 同 位 素 稀 释
4、液 相 色 谱-串 联 质 谱 法,适 用 于 乳、乳 制 品 和 含 乳 特 殊 膳 食 用 食 品 中AFTM1和AFTM2的 测 定。第 二 法 为 高 效 液 相 色 谱 法,适 用 范 围 同 第 一 法。第 三 法 为 酶 联 免 疫 吸 附 筛 查 法,适 用 于 乳、乳 制 品 和 含 乳 特 殊 膳 食 用 食 品 中AFTM1的 筛 查 测 定。第 一 法 同 位 素 稀 释 液 相 色 谱-串 联 质 谱 法2 原 理试 样 中 的 黄 曲 霉 毒 素M1和 黄 曲 霉 毒 素M2用 甲 醇-水 溶 液 提 取,上 清 液 用 水 或 磷 酸 盐 缓 冲 液 稀 释后,经
5、 免 疫 亲 和 柱 净 化 和 富 集,净 化 液 浓 缩、定 容 和 过 滤 后 经 液 相 色 谱 分 离,串 联 质 谱 检 测,同 位 素 内 标法 定 量。3 试 剂 和 材 料除 非 另 有 说 明,本 方 法 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯,水 为GB/T6682规 定 的 一 级 水。3.1 试 剂3.1.1 乙 腈(CH3CN):色 谱 纯。3.1.2 甲 醇(CH3OH):色 谱 纯。3.1.3 乙 酸 铵(CH3COONH4)。3.1.4 氯 化 钠(NaCl)。3.1.5 磷 酸 氢 二 钠(Na 2HPO4)。3.1.6 磷 酸 二 氢 钾(KH2PO4)。3.
6、1.7 氯 化 钾(KCl)。3.1.8 盐 酸(HCl)。3.1.9 石 油 醚(C nH2 n+2):沸 程 为3060。3.2 试 剂 配 制3.2.1 乙 酸 铵 溶 液(5mmo l/L):称 取0.39g乙 酸 铵,溶 于1000mL水 中,混 匀。3.2.2 乙 腈-水 溶 液(25+75):量 取250mL乙 腈 加 入750mL水 中,混 匀。3.2.3 乙 腈-甲 醇 溶 液(50+50):量 取500mL乙 腈 加 入500mL甲 醇 中,混 匀。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 62 3.2.4 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液(以 下 简 称PBS):称 取8.00
7、g氯 化 钠、1.20g磷 酸 氢 二 钠(或2.92g十 二 水 磷 酸氢 二 钠)、0.20g磷 酸 二 氢 钾、0.20g氯 化 钾,用900mL水 溶 解 后,用 盐 酸 调 节pH至7.4,再 加 水 至1000mL。3.3 标 准 品3.3.1 AFTM1标 准 品(C 17H12O7,CAS:6795-23-9):纯 度98%,或 经 国 家 认 证 并 授 予 标 准 物 质 证 书的 标 准 物 质。3.3.2 AFTM2标 准 品(C 17H14O7,CAS:6885-57-0):纯 度98%,或 经 国 家 认 证 并 授 予 标 准 物 质 证 书的 标 准 物 质。3
8、.3.3 13C 17-AFTM1同 位 素 溶 液(C 17H14O7):0.5g/mL。3.4 标 准 溶 液 配 制3.4.1 标 准 储 备 溶 液(10g/mL):分 别 称 取AFTM1和AFTM21mg(精 确 至0.01mg),分 别 用 乙 腈溶 解 并 定 容 至100mL。将 溶 液 转 移 至 棕 色 试 剂 瓶 中,在-20下 避 光 密 封 保 存。临 用 前 进 行 浓 度 校准(校 准 方 法 参 见 附 录A)。3.4.2 混 合 标 准 储 备 溶 液(1.0g/mL):分 别 准 确 吸 取10g/mLAFTM1和AFTM2标 准 储 备 液1.00mL于
9、 同 一10mL容 量 瓶 中,加 乙 腈 稀 释 至 刻 度,得 到1.0g/mL的 混 合 标 准 液。此 溶 液 密 封 后 避 光4保 存,有 效 期3个 月。3.4.3 混 合 标 准 工 作 液(100ng/mL):准 确 吸 取 混 合 标 准 储 备 溶 液(1.0g/mL)1.00mL至10mL容量 瓶 中,乙 腈 定 容。此 溶 液 密 封 后 避 光4下 保 存,有 效 期3个 月。3.4.4 50ng/mL同 位 素 内 标 工 作 液1(13C 17-AFTM1):取AFTM1同 位 素 内 标(0.5g/mL)1mL,用乙 腈 稀 释 至10mL。在-20下 保 存
10、,供 测 定 液 体 样 品 时 使 用。有 效 期3个 月。3.4.5 5ng/mL同 位 素 内 标 工 作 液2(13C 17-AFTM1):取AFTM1同 位 素 内 标(0.5g/mL)100L,用乙 腈 稀 释 至10mL。在-20下 保 存,供 测 定 固 体 样 品 时 使 用。有 效 期3个 月。3.4.6 标 准 系 列 工 作 溶 液:分 别 准 确 吸 取 标 准 工 作 液5L、10L、50L、100L、200L、500L至10mL容 量 瓶 中,加 入100L50ng/mL的 同 位 素 内 标 工 作 液,用 初 始 流 动 相 定 容 至 刻 度,配 制AFTM
11、1和AFTM2的 浓 度 均 为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的系 列 标 准 溶 液。4 仪 器 和 设 备4.1 天 平:感 量0.01g、0.001g和0.00001g。4.2 水 浴 锅:温 控502。4.3 涡 旋 混 合 器。4.4 超 声 波 清 洗 器。4.5 离 心 机:6000r/mi n。4.6 旋 转 蒸 发 仪。4.7 固 相 萃 取 装 置(带 真 空 泵)。4.8 氮 吹 仪。4.9 液 相 色 谱-串 联 质 谱 仪:带 电 喷 雾 离 子 源。4.1 0 圆 孔 筛:1mm2mm孔
12、径。4.1 1 玻 璃 纤 维 滤 纸:快 速,高 载 量,液 体 中 颗 粒 保 留1.6m。4.1 2 一 次 性 微 孔 滤 头:带0.22m微 孔 滤 膜(所 选 用 滤 膜 应 采 用 标 准 溶 液 检 验 确 认 无 吸 附 现 象,方 可G B 5 0 0 9.2 42 0 1 63 使 用)。4.1 3 免 疫 亲 和 柱:柱 容 量100ng(柱 容 量、回 收 率、柱 回 收 率 验 证 方 法 参 见 附 录B)。注:对 于 每 个 批 次 的 亲 和 柱 在 使 用 前 需 进 行 质 量 验 证。5 分 析 步 骤使 用 不 同 厂 商 的 免 疫 亲 和 柱,在
13、样 品 的 上 样、淋 洗 和 洗 脱 的 操 作 方 面 可 能 略 有 不 同,应 该 按 照 供 应商 所 提 供 的 操 作 说 明 书 要 求 进 行 操 作。警 示:整 个 分 析 操 作 过 程 应 在 指 定 区 域 内 进 行。该 区 域 应 避 光(直 射 阳 光),具 备 相 对 独 立 的 操 作 台和 废 弃 物 存 放 装 置。在 整 个 实 验 过 程 中,操 作 者 应 按 照 接 触 剧 毒 物 的 要 求 采 取 相 应 的 保 护 措 施。5.1 样 品 提 取5.1.1 液 态 乳、酸 奶称 取4g混 合 均 匀 的 试 样(精 确 到0.001g)于5
14、0mL离 心 管 中,加 入100L13C 17-AFTM1内 标 溶液(5ng/mL)振 荡 混 匀 后 静 置30mi n,加 入10mL甲 醇,涡 旋3mi n。置 于4、6000r/mi n下 离 心10mi n或 经 玻 璃 纤 维 滤 纸 过 滤,将 适 量 上 清 液 或 滤 液 转 移 至 烧 杯 中,加40mL水 或PBS稀 释,备 用。5.1.2 乳 粉、特 殊 膳 食 用 食 品称 取1g样 品(精 确 到0.001g)于50mL离 心 管 中,加 入100L13C 17-AFTM1内 标 溶 液(5ng/mL)振 荡 混 匀 后 静 置30mi n,加 入4mL50热
15、水,涡 旋 混 匀。如 果 乳 粉 不 能 完 全 溶 解,将 离 心 管 置 于50的 水 浴 中,将 乳 粉 完 全 溶 解 后 取 出。待 样 液 冷 却 至20后,加 入10mL甲 醇,涡 旋3mi n。置 于4、6000r/mi n下 离 心10mi n或 经 玻 璃 纤 维 滤 纸 过 滤,将 适 量 上 清 液 或 滤 液 转 移 至 烧 杯 中,加40mL水 或PBS稀 释,备 用。5.1.3 奶 油称 取1g样 品(精 确 到0.001g)于50mL离 心 管 中,加 入100L13C 17-AFTM1内 标 溶 液(5ng/mL)振 荡 混 匀 后 静 置30mi n,加
16、入8mL石 油 醚,待 奶 油 溶 解,再 加9mL水 和11mL甲 醇,振 荡30mi n,将 全 部 液 体 移 至 分 液 漏 斗 中。加 入0.3g氯 化 钠 充 分 摇 动 溶 解,静 置 分 层 后,将 下 层 移 到 圆 底烧 瓶 中,旋 转 蒸 发 至10mL以 下,用PBS稀 释 至30mL。5.1.4 奶 酪称 取1g已 切 细、过 孔 径1mm2mm圆 孔 筛 混 匀 样 品(精 确 到0.001g)于50mL离 心 管 中,加100L13C 17-AFTM1内 标 溶 液(5ng/mL)振 荡 混 匀 后 静 置30mi n,加 入1mL水 和18mL甲 醇,振 荡30
17、mi n,置 于4、6000r/mi n下 离 心10mi n或 经 玻 璃 纤 维 滤 纸 过 滤,将 适 量 上 清 液 或 滤 液 转 移 至 圆底 烧 瓶 中,旋 转 蒸 发 至2mL以 下,用PBS稀 释 至30mL。5.2 净 化5.2.1 免 疫 亲 和 柱 的 准 备将 低 温 下 保 存 的 免 疫 亲 和 柱 恢 复 至 室 温。5.2.2 净 化免 疫 亲 和 柱 内 的 液 体 放 弃 后,将 上 述 样 液 移 至50mL注 射 器 筒 中,调 节 下 滴 流 速 为1mL/mi nG B 5 0 0 9.2 42 0 1 64 3mL/mi n。待 样 液 滴 完
18、后,往 注 射 器 筒 内 加 入10mL水,以 稳 定 流 速 淋 洗 免 疫 亲 和 柱。待 水 滴 完 后,用 真 空 泵 抽 干 亲 和 柱。脱 离 真 空 系 统,在 亲 和 柱 下 放 置10mL刻 度 试 管,取 下50mL的 注 射 器 筒,加 入22mL乙 腈(或 甲 醇)洗 脱 亲 和 柱,控 制1mL/mi n3mL/mi n下 滴 速 度,用 真 空 泵 抽 干 亲 和 柱,收 集全 部 洗 脱 液 至 刻 度 试 管 中。在50下 氮 气 缓 缓 地 将 洗 脱 液 吹 至 近 干,用 初 始 流 动 相 定 容 至1.0mL,涡旋30s溶 解 残 留 物,0.22m
19、滤 膜 过 滤,收 集 滤 液 于 进 样 瓶 中 以 备 进 样。注:全 自 动(在 线)或 半 自 动(离 线)的 固 相 萃 取 仪 器 可 优 化 操 作 参 数 后 使 用。为 防 止 黄 曲 霉 毒 素M破 坏,相 关 操 作在 避 光(直 射 阳 光)条 件 下 进 行。5.3 液 相 色 谱 参 考 条 件液 相 色 谱 参 考 条 件 列 出 如 下:a)液 相 色 谱 柱:C 18柱(柱 长100mm,柱 内 径2.1mm,填 料 粒 径1.7m),或 相 当 者。b)色 谱 柱 柱 温:40。c)流 动 相:A相,5mmo l/L乙 酸 铵 水 溶 液;B相,乙 腈-甲
20、醇(50+50)。梯 度 洗 脱:参 见 表1。d)流 速:0.3mL/mi n。e)进 样 体 积:10L。5.4 质 谱 参 考 条 件质 谱 参 考 条 件 列 出 如 下:a)检 测 方 式:多 离 子 反 应 监 测(MRM);b)离 子 源 控 制 条 件:参 见 表2;c)离 子 选 择 参 数:见 表3;d)液 相 色 谱-质 谱 图 和 子 离 子 扫 描 图:见 附 录C。表1 液 相 色 谱 梯 度 洗 脱 条 件时 间/mi n流 动 相A/%流 动 相B/%梯 度 变 化 曲 线0.0 68.0 32.00.5 68.0 32.0 14.2 55.0 45.0 65.
21、0 0.0 100.0 65.7 0.0 100.0 16.0 68.0 32.0 6表2 离 子 源 控 制 条 件电 离 方 式ES I+毛 细 管 电 压/kV 17.5锥 孔 电 压/V 45射 频 透 镜1电 压/V 12.5射 频 透 镜2电 压/V 12.5G B 5 0 0 9.2 42 0 1 65 表2(续)离 子 源 温 度/120锥 孔 反 吹 气 流 量/(L/h)50脱 溶 剂 气 温 度/350脱 溶 剂 气 流 量/(L/h)500电 子 倍 增 电 压/V 650表3 质 谱 条 件 参 数化 合 物 名 称母 离 子(m/z)定 量 子 离 子(m/z)碰
22、撞 能 量eV定 性 子 离 子(m/z)碰 撞 能 量eV离 子 化 方 式AFTM1 329 273 23 259 23 ES I+13C-AFTM1 346 317 23 288 24 ES I+AFTM2 331 275 23 261 22 ES I+5.5 定 性 测 定试 样 中 目 标 化 合 物 色 谱 峰 的 保 留 时 间 与 相 应 标 准 色 谱 峰 的 保 留 时 间 相 比 较,变 化 范 围 应 在2.5%之 内。每 种 化 合 物 的 质 谱 定 性 离 子 必 须 出 现,至 少 应 包 括 一 个 母 离 子 和 两 个 子 离 子,而 且 同 一 检 测
23、批 次,对 同 一 化 合 物,样 品 中 目 标 化 合 物 的 两 个 子 离 子 的 相 对 丰 度 比 与 浓 度 相 当 的 标 准 溶 液 相 比,其 允 许 偏 差不 超 过 表4规 定 的 范 围。表4 定 性 时 相 对 离 子 丰 度 的 最 大 允 许 偏 差相 对 离 子 丰 度/%50 2050 1020 10允 许 相 对 偏 差/%20 25 30 505.6 标 准 曲 线 的 制 作在5.3、5.4液 相 色 谱-串 联 质 谱 仪 分 析 条 件 下,将 标 准 系 列 溶 液 由 低 到 高 浓 度 进 样 检 测,以AFTM1和AFTM2色 谱 峰 与
24、内 标 色 谱 峰13C 17-AFTM1的 峰 面 积 比 值-浓 度 作 图,得 到 标 准 曲 线 回 归 方 程,其 线性 相 关 系 数 应 大 于0.99。5.7 试 样 溶 液 的 测 定取5.2下 处 理 得 到 的 待 测 溶 液 进 样,内 标 法 计 算 待 测 液 中 目 标 物 质 的 质 量 浓 度,按 第6章 计 算 样 品中 待 测 物 的 含 量。5.8 空 白 试 验不 称 取 试 样,按5.1和5.2的 步 骤 做 空 白 实 验。应 确 认 不 含 有 干 扰 待 测 组 分 的 物 质。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 66 6 分 析 结 果
25、 的 表 述试 样 中AFTM1或AFTM2的 残 留 量 按 式(1)计 算:X=V f 1000m 1000(1)式 中:X 试 样 中AFTM1或AFTM2的 含 量,单 位 为 微 克 每 千 克(g/kg);进 样 溶 液 中AFTM1或AFTM2按 照 内 标 法 在 标 准 曲 线 中 对 应 的 浓 度,单 位 为 纳 克 每 毫升(ng/mL);V 样 品 经 免 疫 亲 和 柱 净 化 洗 脱 后 的 最 终 定 容 体 积,单 位 为 毫 升(mL);f 样 液 稀 释 因 子;1000 换 算 系 数;m 试 样 的 称 样 量,单 位 为 克(g)。计 算 结 果 保
26、 留 三 位 有 效 数 字。7 精 密 度在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的20%。8 其 他称 取 液 态 乳、酸 奶4g时,本 方 法AFTM1检 出 限 为0.005g/kg,AFTM2检 出 限 为0.005g/kg,AFTM1定 量 限 为0.015g/kg,AFTM2定 量 限 为0.015g/kg。称 取 乳 粉、特 殊 膳 食 用 食 品、奶 油 和 奶 酪1g时,本 方 法AFTM1检 出 限 为0.02g/kg,AFTM2检出 限 为0.02g/kg,AFTM1定 量 限 为0
27、.05g/kg,AFTM2定 量 限 为0.05g/kg。第 二 法 高 效 液 相 色 谱 法9 原 理试 样 中 的 黄 曲 霉 毒 素M1和 黄 曲 霉 毒 素M2用 甲 醇-水 溶 液 提 取,上 清 液 稀 释 后,经 免 疫 亲 和 柱 净 化和 富 集,净 化 液 浓 缩、定 容 和 过 滤 后 经 液 相 色 谱 分 离,荧 光 检 测 器 检 测。外 标 法 定 量。1 0 试 剂 和 材 料除 非 另 有 说 明,本 方 法 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯,水 为GB/T6682规 定 的 一 级 水。1 0.1 试 剂1 0.1.1 乙 腈(CH3CN):色 谱 纯。
28、1 0.1.2 甲 醇(CH3OH):色 谱 纯。1 0.1.3 氯 化 钠(NaCl)。1 0.1.4 磷 酸 氢 二 钠(Na 2HPO4)。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 67 1 0.1.5 磷 酸 二 氢 钾(KH2PO4)。1 0.1.6 氯 化 钾(KCl)。1 0.1.7 盐 酸(HCl)。1 0.1.8 石 油 醚(C nH2 n+2):沸 程 为3060。1 0.2 试 剂 配 制1 0.2.1 乙 腈-水 溶 液(25+75):量 取250mL乙 腈 加 入750mL水 中,混 匀。1 0.2.2 乙 腈-甲 醇 溶 液(50+50):量 取500mL乙 腈 加
29、 入500mL甲 醇 中,混 匀。1 0.2.3 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液(以 下 简 称PBS):称 取8.00g氯 化 钠、1.20g磷 酸 氢 二 钠(或2.92g十 二 水 磷酸 氢 二 钠)、0.20g磷 酸 二 氢 钾、0.20g氯 化 钾,用900mL水 溶 解 后,用 盐 酸 调 节pH至7.4,再 加 水 至1000mL。1 0.3 标 准 品1 0.3.1 AFTM1标 准 品(C 17H12O7,CAS:6795-23-9):纯 度98%,或 经 国 家 认 证 并 授 予 标 准 物 质 证 书的 标 准 物 质。1 0.3.2 AFTM2标 准 品(C 17H14O
30、7,CAS:6885-57-0):纯 度98%,或 经 国 家 认 证 并 授 予 标 准 物 质 证 书的 标 准 物 质。1 0.4 标 准 溶 液 配 制1 0.4.1 标 准 储 备 溶 液(10g/mL):分 别 称 取AFTM1和AFTM21mg(精 确 至0.01mg),分 别 用 乙 腈溶 解 并 定 容 至100mL。将 溶 液 转 移 至 棕 色 试 剂 瓶 中,在-20下 避 光 密 封 保 存。临 用 前 进 行 浓 度 校准(校 准 方 法 参 见 附 录A)。1 0.4.2 混 合 标 准 储 备 溶 液(1.0g/mL):分 别 准 确 吸 取10g/mLAFTM
31、1和AFTM2标 准 储 备 液1.00mL于 同 一10mL容 量 瓶 中,加 乙 腈 稀 释 至 刻 度,得 到1.0g/mL的 混 合 标 准 液。此 溶 液 密 封 后避 光4保 存,有 效 期3个 月。1 0.4.3 100ng/mL混 合 标 准 工 作 液(AFTM1和AFTM2):准 确 移 取 混 合 标 准 储 备 溶 液(1.0g/mL)1.0mL至10mL容 量 瓶 中,加 乙 腈 稀 释 至 刻 度。此 溶 液 密 封 后 避 光4下 保 存,有 效 期3个 月。1 0.4.4 标 准 系 列 工 作 溶 液:分 别 准 确 移 取 标 准 工 作 液5L、10L、5
32、0L、100L、200L、500L至10mL容 量 瓶 中,用 初 始 流 动 相 定 容 至 刻 度,AFTM1和AFTM2的 浓 度 均 为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的 系 列 标 准 溶 液。1 1 仪 器 和 设 备1 1.1 天 平:感 量0.01g、0.001g和0.00001g。1 1.2 水 浴 锅:温 控502。1 1.3 涡 旋 混 合 器。1 1.4 超 声 波 清 洗 器。1 1.5 离 心 机:转 速6000r/mi n。1 1.6 旋 转 蒸 发 仪。1 1.7 固 相 萃 取 装 置
33、(带 真 空 泵)。1 1.8 氮 吹 仪。1 1.9 圆 孔 筛:1mm2mm孔 径。1 1.1 0 液 相 色 谱 仪(带 荧 光 检 测 器)。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 68 1 1.1 1 玻 璃 纤 维 滤 纸:快 速、高 载 量、液 体 中 颗 粒 保 留1.6m。1 1.1 2 一 次 性 微 孔 滤 头:带0.22m微 孔 滤 膜。1 1.1 3 免 疫 亲 和 柱:柱 容 量100ng。(柱 容 量、回 收 率、柱 回 收 率 验 证 方 法 参 见 附 录B)。注:对 于 不 同 批 次 的 亲 和 柱 在 使 用 前 需 进 行 质 量 验 证。1 2 分
34、 析 步 骤使 用 不 同 厂 商 的 免 疫 亲 和 柱,在 样 品 的 上 样、淋 洗 和 洗 脱 的 操 作 方 面 可 能 略 有 不 同,应 该 按 照 供 应商 所 提 供 的 操 作 说 明 书 要 求 进 行 操 作。警 示:整 个 分 析 操 作 过 程 应 在 指 定 区 域 内 进 行。该 区 域 应 避 光(直 射 阳 光),具 备 相 对 独 立 的 操 作 台和 废 弃 物 存 放 装 置。在 整 个 实 验 过 程 中,操 作 者 应 按 照 接 触 剧 毒 物 的 要 求 采 取 相 应 的 保 护 措 施。1 2.1 试 液 提 取除 不 加 同 位 素 内
35、标 溶 液,方 法 同5.1。1 2.2 净 化方 法 同5.2。1 2.3 液 相 色 谱 参 考 条 件液 相 色 谱 参 考 条 件 列 出 如 下:a)液 相 色 谱 柱:C 18柱(柱 长150mm,柱 内 径4.6mm;填 料 粒 径5m),或 相 当 者。b)柱 温:40。c)流 动 相:A相,水;B相,乙 腈-甲 醇(50+50)。等 梯 度 洗 脱 条 件:A,70%;B,30%。d)流 速;1.0mL/mi n。e)荧 光 检 测 波 长:发 射 波 长360nm;激 发 波 长430nm。f)进 样 量:50L。液 相 色 谱 图 见 附 录D。1 2.4 测 定1 2.
36、4.1 标 准 曲 线 的 制 作将 系 列 标 准 溶 液 由 低 到 高 浓 度 依 次 进 样 检 测,以 峰 面 积-浓 度 作 图,得 到 标 准 曲 线 回 归 方 程。1 2.4.2 试 样 溶 液 的 测 定待 测 样 液 中 的 响 应 值 应 在 标 准 曲 线 线 性 范 围 内,超 过 线 性 范 围 的 则 应 稀 释 后 重 新 进 样 分 析。1 2.4.3 空 白 试 验不 称 取 试 样,按12.1和12.2的 步 骤 做 空 白 实 验。确 认 不 含 有 干 扰 待 测 组 分 的 物 质。1 3 分 析 结 果 的 表 述试 样 中AFTM1或AFTM2
37、的 残 留 量 按 式(2)计 算:X=V f 1000m 1000(2)G B 5 0 0 9.2 42 0 1 69 式 中:X 试 样 中AFTM1或AFTM2的 含 量,单 位 为 微 克 每 千 克(g/kg);进 样 溶 液 中AFTM1或AFTM2的 色 谱 峰 由 标 准 曲 线 所 获 得AFTM1或AFTM2的 浓度,单 位 为 纳 克 每 毫 升(ng/mL);V 样 品 经 免 疫 亲 和 柱 净 化 洗 脱 后 的 最 终 定 容 体 积,单 位 为 毫 升(mL);f 样 液 稀 释 因 子;1000 换 算 系 数;m 试 样 的 称 样 量,单 位 为 克(g)
38、。计 算 结 果 保 留 三 位 有 效 数 字。1 4 精 密 度在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的20%。1 5 其 他称 取 液 态 乳、酸 奶4g时,本 方 法AFTM1检 出 限 为0.005g/kg,AFTM2检 出 限 为0.0025g/kg,AFTM1定 量 限 为0.015g/kg,AFTM2定 量 限 为0.0075g/kg。称 取 乳 粉、特 殊 膳 食 用 食 品、奶 油 和 奶 酪1g时,本 方 法AFTM1检 出 限 为0.02g/kg,AFTM2检出 限 为0.01g/
39、kg,AFTM1定 量 限 为0.05g/kg,AFTM2定 量 限 为0.025g/kg。第 三 法 酶 联 免 疫 吸 附 筛 查 法1 6 原 理试 样 中 的 黄 曲 霉 毒 素M1经 均 质、冷 冻 离 心、脱 脂 或 有 机 溶 剂 萃 取 等 处 理 获 得 上 清 液。利 用 被 辣 根过 氧 化 物 酶 标 记 或 固 定 在 反 应 孔 中 的 黄 曲 霉 毒 素M1与 样 品 或 标 准 品 中 的 黄 曲 霉 毒 素M1竞 争 性 结 合特 异 性 抗 体。在 洗 涤 后 加 入 相 应 显 色 剂 显 色,经 无 机 酸 终 止 反 应,于450nm或630nm波 长
40、 下 检 测。样 品 中 的 黄 曲 霉 毒 素M1与 吸 光 度 在 一 定 浓 度 范 围 内 呈 反 比。1 7 试 剂 和 溶 剂配 制 溶 液 所 需 试 剂 均 为 分 析 纯,水 为GB/T6682规 定 的 二 级 水。按 照 试 剂 盒 说 明 书 所 述,配 制 所 需 溶 液。所 用 商 品 化 的 试 剂 盒 需 按 照 附 录E所 述 方 法 验 证 合 格 后 方 可 使 用。1 8 仪 器 和 设 备1 8.1 微 孔 板 酶 标 仪:带450nm与630nm(可 选)滤 光 片。1 8.2 天 平:最 小 感 量0.01g。1 8.3 离 心 机:转 速6000
41、r/mi n。1 8.4 旋 涡 混 合 器。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 610 1 9 分 析 步 骤1 9.1 样 品 前 处 理1 9.1.1 液 态 样 品取 约100g待 测 样 品 摇 匀,将 其 中10g样 品 用 离 心 机 在6000r/mi n或 更 高 转 速 下 离 心10mi n。取 下 层 液 体 约1g于 另 一 试 管 内,该 溶 液 可 直 接 测 定,或 者 利 用 试 剂 盒 提 供 的 方 法 稀 释 后 测 定(待 测液)。1 9.1.2 乳 粉、特 殊 膳 食 用 食 品称 取10g待 测 样 品(精 确 到0.1g)到 小 烧 杯 中
42、,加 水 溶 解,转 移 到100mL容 量 瓶 中,用 水 定 容 至 刻度。以 下 步 骤 同19.1.1。1 9.1.3 奶 酪称 取50g待 测 样 品(精 确 到0.1g),去 除 表 面 非 食 用 部 分,硬 质 奶 酪 可 用 粉 碎 机 直 接 粉 碎;软 质 奶酪 需 先 在-20冷 冻 过 夜,然 后 立 即 用 粉 碎 机 进 行 粉 碎。称 取5g混 合 均 匀 的 待 测 样 品(精 确 到0.1g),加 入 试 剂 盒 所 提 供 的 提 取 液,按 照 试 剂 盒 说 明 书 进 行 提 取,提 取 液 即 为 待 测 液。1 9.2 定 量 检 测按 照 酶
43、联 免 疫 试 剂 盒 所 述 操 作 步 骤 对 待 测 试 样(液)进 行 定 量 检 测。2 0 分 析 结 果 的 表 述2 0.1 酶 联 免 疫 试 剂 盒 定 量 检 测 的 标 准 工 作 曲 线 绘 制根 据 标 准 品 浓 度 与 吸 光 度 变 化 关 系 绘 制 标 准 工 作 曲 线。2 0.2 待 测 液 浓 度 计 算将 待 测 液 吸 光 度 代 入20.1所 获 得 公 式,计 算 得 待 测 液 浓 度。2 0.3 结 果 计 算食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M1的 含 量 按 式(3)计 算:X=V fm(3)式 中:X 食 品 中 黄 曲 霉 毒 素M1
44、的 含 量,单 位 为 微 克 每 千 克(g/kg);待 测 液 中 黄 曲 霉 毒 素M1的 浓 度,单 位 为 微 克 每 升(g/L);V 定 容 体 积(针 对 乳 粉、特 殊 膳 食 用 食 品、液 态 样 品)或 者 提 取 液 体 积(针 对 奶 酪),单 位 为 升(L);f 稀 释 倍 数;m 样 品 取 样 量,单 位 为 千 克(kg)。计 算 结 果 保 留 小 数 点 后 两 位。注:阳 性 样 品 需 用 第 一 法 或 第 二 法 进 一 步 确 认。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 611 2 1 精 密 度在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两
45、次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 数 平 均 值 的20%。2 2 其 他称 取 液 态 乳10g时,方 法 检 出 限 为0.01g/kg,定 量 限 为0.03g/kg。称 取 乳 粉 和 含 乳 特 殊 膳 食 用 食 品10g时,方 法 检 出 限 为0.1g/kg,定 量 限 为0.3g/kg。称 取 奶 酪5g时,方 法 检 出 限 为0.02g/kg,定 量 限 为0.06g/kg。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 612 附 录 AA F T M 1、A F T M 2的 标 准 浓 度 校 准 方 法 用 乙 腈 溶 液 配 制8g/
46、mL10g/mL的AFTM1、AFTM2的 标 准 溶 液。根 据 下 面 的 方 法,在 最大 吸 收 波 段 处 测 定 溶 液 的 吸 光 度,确 定AFTM1、AFTM2的 实 际 浓 度。用 分 光 光 度 计 在340nm370nm处 测 定,经 扣 除 溶 剂 的 空 白 试 剂 本 底,校 正 比 色 皿 系 统 误 差 后,读 取 标 准 溶 液 的 最 大 吸 收 波 长(max)处 吸 光 度 值A。校 准 溶 液 实 际 浓 度按 式(A.1)计 算:=A M 1000(A.1)式 中:校 准 测 定 的AFTM1、AFTM2的 实 际 浓 度,单 位 为 微 克 每
47、毫 升(g/mL);A 在max处 测 得 的 吸 光 度 值;MAFTM1、AFTM2摩 尔 质 量,单 位 为 克 每 摩 尔(g/mo l);AFTM1、AFTM2的 吸 光 系 数,单 位 为 平 方 米 每 摩 尔(m2/mo l)。表A.1 A F T M 1的 摩 尔 质 量 及 摩 尔 吸 光 系 数黄 曲 霉 毒 素 名 称 摩 尔 质 量/(g/mo l)溶 剂 摩 尔 吸 光 系 数/(m2/mo l)AFTM1 328乙 腈19000AFTM2 330乙 腈21400G B 5 0 0 9.2 42 0 1 613 附 录 B免 疫 亲 和 柱 的 柱 容 量 验 证
48、方 法B.1 柱 容 量 验 证在30mL的PBS中 加 入300ngAFTM1标 准 储 备 溶 液,充 分 混 匀。分 别 取 同 一 批 次3根 免 疫 亲 和柱,每 根 柱 的 上 样 量 为10mL。经 上 样、淋 洗、洗 脱,收 集 洗 脱 液,用 氮 气 吹 干 至1mL,用 初 始 流 动 相 定容 至10mL,用 液 相 色 谱 仪 分 离 测 定AFTM1的 含 量。结 果 判 定:结 果AFTM180ng,为 可 使 用 商 品。B.2 柱 回 收 率 验 证 方 法在30mL的PBS中 加 入300ngAFTM1标 准 储 备 溶 液,充 分 混 匀。分 别 取 同 一
49、 批 次3根 免 疫 亲 和柱,每 根 柱 的 上 样 量 为10mL。经 上 样、淋 洗、洗 脱,收 集 洗 脱 液,用 氮 气 吹 干 至1mL,用 初 始 流 动 相 定容 至10mL,用 液 相 色 谱 仪 分 离 测 定AFTM1的 含 量。结 果 判 定:结 果AFTM180ng,为 可 使 用 商 品。B.3 交 叉 反 应 率 验 证在30mL的PBS中 加 入300ngAFTM2标 准 储 备 溶 液,充 分 混 匀。分 别 取 同 一 批 次3根 免 疫 亲 和柱,每 根 柱 的 上 样 量 为10mL。经 上 样、淋 洗、洗 脱,收 集 洗 脱 液,用 氮 气 吹 干 至
50、1mL,用 初 始 流 动 相 定容 至10mL,用 液 相 色 谱 仪 分 离 测 定AFTM2的 含 量。结 果 判 定:结 果AFTM280ng,当 需 要 同 时 测 定AFTM1、AFTM2时 使 用 的 商 品。G B 5 0 0 9.2 42 0 1 614 附 录 C液 相 色 谱-质 谱 图 和 子 离 子 扫 描 图C.1 AFTM1子 离 子 扫 描 图 见 图C.1。图C.1 A F T M 1子 离 子 扫 描 图C.2 AFTM2子 离 子 扫 描 图 见 图C.2。图C.2 A F T M 2子 离 子 扫 描 图G B 5 0 0 9.2 42 0 1 615
