1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 6食 品 安 全 国 家 标 准食 品 中 维 生 素K1的 测 定2 0 1 6-1 2-2 3发 布2 0 1 7-0 6-2 3实 施中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 6 前 言 本 标 准 代 替GB/T5009.1582003 蔬 菜 中 维 生 素K1的 测 定 和GB5413.102010 食 品 安 全 国家 标 准 婴 幼 儿 食 品 和 乳 品 中 维
2、 生 素K1的 测 定。本 标 准 与GB/T5009.1582003相 比,主 要 变 化 如 下:标 准 名 称 修 改 为“食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 中 维 生 素K1的 测 定”;增 加 了 高 效 液 相 色 谱-荧 光 检 测 法;增 加 了 液 相 色 谱-串 联 质 谱 法;删 除 了 高 效 液 相 色 谱-紫 外 检 测 法。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 61 食 品 安 全 国 家 标 准食 品 中 维 生 素K 1的 测 定1 范 围本 标 准 规 定 了 食 品 中 维 生 素K1的 测 定 方 法。本 标 准 第 一 法 为 高 效 液
3、 相 色 谱-荧 光 检 测 法,第 二 法 为 液 相 色 谱-串 联 质 谱 法,均 适 用 于 各 类 配 方 食品、植 物 油、水 果 和 蔬 菜 中 维 生 素K1的 测 定。第 一 法 高 效 液 相 色 谱-荧 光 检 测 法2 原 理婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油 等 样 品 经 脂 肪 酶 和 淀 粉 酶 酶 解,正 己 烷 提 取 样 品 中 的 维 生 素K1后,用C 18液 相 色 谱 柱 将 维 生 素K1与 其 他 杂 质 分 离,锌 柱 柱 后 还 原,荧 光 检 测 器 检 测,外 标 法 定 量。水 果、蔬 菜 等 低 脂 性 植 物 样 品,用
4、异 丙 醇 和 正 己 烷 提 取 其 中 的 维 生 素K1,经 中 性 氧 化 铝 柱 净 化,去除 叶 绿 素 等 干 扰 物 质。用C 18液 相 色 谱 柱 将 维 生 素K1与 其 他 杂 质 分 离,锌 柱 柱 后 还 原,荧 光 检 测 器 检测,外 标 法 定 量。3 试 剂 和 材 料除 非 另 有 说 明,本 方 法 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯,水 为GB/T6682规 定 的 一 级 水。3.1 试 剂3.1.1 无 水 乙 醇(CH3CH2OH)。3.1.2 碳 酸 钾(K2CO3)。3.1.3 无 水 硫 酸 钠(Na 2SO4)。3.1.4 异 丙 醇(C
5、 3H8O)。3.1.5 正 己 烷(C 6H14)。3.1.6 甲 醇(CH3OH):色 谱 纯。3.1.7 四 氢 呋 喃(C 4H8O):色 谱 纯。3.1.8 乙 酸 乙 酯(C 4H8O2)。3.1.9 冰 乙 酸(CH3COOH):色 谱 纯。3.1.1 0 氯 化 锌(ZnCl 2):色 谱 纯。3.1.1 1 无 水 乙 酸 钠(CH3COONa)。3.1.1 2 氢 氧 化 钾(KOH)。3.1.1 3 脂 肪 酶:酶 活 力700U/mg。3.1.1 4 淀 粉 酶:酶 活 力1.5U/mg。3.1.1 5 锌 粉:粒 径50m70m。G B 5 0 0 9.1 5 82
6、0 1 62 3.2 试 剂 配 制3.2.1 40%氢 氧 化 钾 溶 液:称 取20g氢 氧 化 钾 于100mL烧 杯 中,用20mL水 溶 解,冷 却 后,加 水 至50mL,储 存 于 聚 乙 烯 瓶 中。3.2.2 磷 酸 盐 缓 冲 液(pH8.0):溶 解54.0g磷 酸 二 氢 钾 于300mL水 中,用40%氢 氧 化 钾 溶 液 调 节pH至8.0,加 水 至500mL。3.2.3 正 己 烷-乙 酸 乙 酯 混 合 液(90+10):量 取90mL正 己 烷,加 入10mL乙 酸 乙 酯,混 匀。3.2.4 流 动 相:量 取 甲 醇900mL,四 氢 呋 喃100mL
7、,冰 乙 酸0.3mL,混 匀 后,加 入 氯 化 锌1.5g,无 水 乙酸 钠0.5g,超 声 溶 解 后,用0.22m有 机 系 滤 膜 过 滤。3.3 标 准 品维 生 素K1(C 31H46O2,CAS号:84-80-0):纯 度99%,或 经 国 家 认 证 并 授 予 标 准 物 质 证 书 的 标 准物 质。3.4 标 准 溶 液 配 制3.4.1 维 生 素K1标 准 贮 备 溶 液(1mg/mL):准 确 称 取50mg(精 确 至0.1mg)维 生 素K1标 准 品 于50mL容 量 瓶 中,用 甲 醇 溶 解 并 定 容 至 刻 度。将 溶 液 转 移 至 棕 色 玻 璃
8、 容 器 中,在-20下 避 光 保 存,保 存期2个 月。标 准 储 备 液 在 使 用 前 需 要 进 行 浓 度 校 正,校 正 方 法 参 照 附 录A。3.4.2 维 生 素K1标 准 中 间 液(100g/mL):准 确 吸 取 标 准 贮 备 溶 液10.00mL于100mL容 量 瓶 中,加甲 醇 至 刻 度,摇 匀。将 溶 液 转 移 至 棕 色 玻 璃 容 器 中,在-20下 避 光 保 存,保 存 期2个 月。3.4.3 维 生 素K1标 准 使 用 液(1.00g/mL):准 确 吸 取 标 准 中 间 液1.00mL于100mL容 量 瓶 中,加 甲醇 至 刻 度,摇
9、 匀。3.4.4 标 准 系 列 工 作 溶 液:分 别 准 确 吸 取 维 生 素K1标 准 使 用 液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL于10mL容 量 瓶 中,加 甲 醇 定 容 至 刻 度,维 生 素K1标 准 系 列 工 作 溶 液 浓 度 分 别 为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。3.5 材 料3.5.1 中 性 氧 化 铝:粒 径50m150m。3.5.2 中 性 氧 化 铝 柱:2g/6mL,填 料 中 含10%水,可 直 接 购 买 商 品 柱,也 可 自 行
10、 装 填。注:中 性 氧 化 铝 柱 装 填 方 法:a)填 料 处 理:取200g中 性 氧 化 铝 于500mL的 广 口 瓶 中,于150干 燥 箱 中 烘 烤2h,加 盖 后 于 干 燥 器 中 冷却 至 室 温,缓 慢 加 入20mL纯 水,边 加 边 摇,加 完 后 加 上 瓶 盖,放 入80烘 箱 中3mi n5mi n,取 出 后,剧烈 振 摇,直 至 瓶 内 氧 化 铝 自 由 流 动,无 结 块,置 于 干 燥 器 中 冷 却30mi n,备 用。b)层 析 柱 装 填:取6mL的 针 筒 式 柱 套,加 入 筛 板,称 取2.00g上 述 经 脱 活 化 处 理 的 填
11、料,再 加 入 一 块 筛 板,用 装 填 工 具 压 紧。3.5.3 锌 柱:柱 长50mm,内 径4.6mm,锌 柱 可 直 接 购 买 商 品 柱,也 可 自 行 装 填。注:a)锌 柱 填 装 方 法:将 锌 粉 密 集 装 入 不 锈 钢 材 质 的 柱 套(柱 长50mm,内 径4.6mm)中。装 柱 时,应 连 续 少 量 多次 将 锌 粉 装 入 柱 中,边 装 边 轻 轻 拍 打,以 使 装 入 的 锌 粉 紧 密。b)锌 柱 接 入 仪 器 前,须 将 液 相 色 谱 仪 所 用 管 路 中 的 水 排 干。3.5.4 微 孔 滤 头:带0.22m有 机 系 微 孔 滤 膜
12、。4 仪 器 和 设 备4.1 高 效 液 相 色 谱 仪:带 荧 光 检 测 器。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 63 4.2 匀 浆 机。4.3 高 速 粉 碎 机。4.4 组 织 捣 碎 机。4.5 涡 旋 振 荡 器。4.6 恒 温 水 浴 振 荡 器。4.7 pH计:精 度0.01。4.8 天 平:感 量 为1mg和0.1mg。4.9 离 心 机:转 速6000r/mi n。4.1 0 旋 转 蒸 发 仪。4.1 1 氮 吹 仪。4.1 2 超 声 波 振 荡 器。5 分 析 步 骤5.1 试 样 制 备米 粉、奶 粉 等 粉 状 样 品 经 混 匀 后,直 接 取 样
13、;片 状、颗 粒 状 样 品,经 样 本 粉 碎 机 磨 成 粉,储 存 于 样 品 袋中 备 用;液 态 乳、植 物 油 等 液 态 样 品 摇 匀 后,直 接 取 样;水 果、蔬 菜 等 取 可 食 部 分,水 洗 干 净,用 纱 布 擦 去表 面 水 分,经 匀 浆 器 匀 浆,储 存 于 样 品 瓶 中 备 用。制 样 后,需 尽 快 测 定。5.2 试 样 处 理警 示:处 理 过 程 应 避 免 紫 外 光 直 接 照 射,尽 可 能 避 光 操 作。5.2.1 婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油5.2.1.1 酶 解准 确 称 取 经 均 质 的 试 样1g5g(精 确
14、到0.01g,维 生 素K1含 量 不 低 于0.05g)于50mL离 心 管中,加 入5mL温 水 溶 解(液 体 样 品 直 接 吸 取5mL,植 物 油 不 需 加 水 稀 释),加 入 磷 酸 盐 缓 冲 液(pH8.0)5mL,混 匀,加 入0.2g脂 肪 酶 和0.2g淀 粉 酶(不 含 淀 粉 的 样 品 可 以 不 加 淀 粉 酶),加 盖,涡 旋2mi n3mi n,混 匀 后,置 于372恒 温 水 浴 振 荡 器 中 振 荡2h以 上,使 其 充 分 酶 解。5.2.1.2 提 取取 出 酶 解 好 的 试 样,分 别 加 入10mL乙 醇 及1g碳 酸 钾,混 匀 后
15、加 入10mL正 己 烷 和10mL水,涡旋 或 振 荡 提 取10mi n,6000r/mi n离 心5mi n,或 将 酶 解 液 转 移 至150mL的 分 液 漏 斗 中 萃 取 提 取,静置 分 层(如 发 生 乳 化 现 象,可 适 当 增 加 正 己 烷 或 水 的 加 入 量,以 排 除 乳 化 现 象),转 移 上 清 液 至100mL旋 蒸 瓶 中,向 下 层 液 再 加 入10mL正 己 烷,重 复 操 作1次,合 并 上 清 液 至 上 述 旋 蒸 瓶 中。5.2.1.3 浓 缩将 上 述 正 己 烷 提 取 液 旋 蒸 至 干(如 有 残 液,可 用 氮 气 轻 吹
16、至 干),用 甲 醇 转 移 并 定 容 至5mL容 量 瓶中,摇 匀,0.22m滤 膜 过 滤,滤 液 待 进 样。不 加 试 样,按 同 一 操 作 方 法 做 空 白 试 验。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 64 5.2.2 水 果、蔬 菜 样 品5.2.2.1 提 取准 确 称 取1g5g(精 确 到0.01g,维 生 素K1含 量 不 低 于0.05g)经 均 质 匀 浆 的 样 品 于50mL离心 管 中,加 入5mL异 丙 醇,涡 旋1mi n,超 声5mi n,再 加 入10mL正 己 烷,涡 旋 振 荡 提 取3mi n,6000r/mi n离 心5mi n,移
17、 取 上 清 液 于25mL棕 色 容 量 瓶 中,向 下 层 溶 液 中 加 入10mL正 己 烷,重 复 提取1次,合 并 上 清 液 于 上 述 容 量 瓶 中,正 己 烷 定 容 至 刻 度,用 移 液 管 准 确 分 取 上 清 液1mL5mL(视 样品 中 维 生 素K1含 量 而 定)至10mL试 管 中,氮 气 轻 吹 至 干,加 入1mL正 己 烷 溶 解,待 净 化。5.2.2.2 净 化、浓 缩将 上 述1mL提 取 液 用 少 量 正 己 烷 转 移 至 预 先 用5mL正 己 烷 活 化 的 中 性 氧 化 铝 柱 中,待 提 取 液 流至 近 干 时,5mL正 己
18、烷 淋 洗,6mL正 己 烷-乙 酸 乙 酯 混 合 液 洗 脱 至10mL试 管 中,氮 气 吹 干 后,用 甲 醇定 容 至5mL,过0.22m滤 膜,滤 液 供 分 析 测 定。不 加 试 样,按 同 一 操 作 方 法 做 空 白 试 验。5.3 色 谱 参 考 条 件a)色 谱 柱:C 18柱,柱 长250mm,内 径4.6mm,粒 径5m,或 具 同 等 性 能 的 色 谱 柱;b)锌 还 原 柱:柱 长50mm,内 径4.6mm;c)流 动 相:按3.2.4配 制;d)流 速:1mL/mi n;e)检 测 波 长:激 发 波 长 为243nm,发 射 波 长 为430nm;f)进
19、 样 量:10L;g)标 准 溶 液 的 色 谱 图 见 附 录B。5.4 标 准 曲 线 的 制 作采 用 外 标 标 准 曲 线 法 进 行 定 量。将 维 生 素K1标 准 系 列 工 作 液 分 别 注 入 高 效 液 相 色 谱 仪 中,测 定相 应 的 峰 面 积,以 峰 面 积 为 纵 坐 标,以 标 准 系 列 工 作 液 浓 度 为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线,计 算 线 性 回 归 方 程。5.5 试 样 溶 液 的 测 定在 相 同 色 谱 条 件 下,将 制 备 的 空 白 溶 液 和 试 样 溶 液 分 别 进 样,进 行 高 效 液 相 色 谱 分 析。以
20、保 留 时 间定 性,峰 面 积 外 标 法 定 量,根 据 线 性 回 归 方 程 计 算 出 试 样 溶 液 中 维 生 素K1的 浓 度。6 分 析 结 果 的 表 述试 样 中 维 生 素K1的 含 量 按 式(1)计 算:X=V1 V3 100m V2 1000(1)式 中:X 试 样 中 维 生 素K1的 含 量,单 位 为 微 克 每 百 克(g/100g);由 标 准 曲 线 得 到 的 试 样 溶 液 中 维 生 素K1的 浓 度,单 位 为 纳 克 每 毫 升(ng/mL);V1 提 取 液 总 体 积,单 位 为 毫 升(mL);V3 定 容 液 的 体 积,单 位 为
21、毫 升(mL);G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 65 100 将 结 果 单 位 由 微 克 每 克 换 算 为 微 克 每 百 克 样 品 中 含 量 的 换 算 系 数;m 试 样 的 称 样 量,单 位 为 克(g);V2 分 取 的 提 取 液 体 积(婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油V1=V2),单 位 为 毫 升(mL);1000 将 浓 度 单 位 由ng/mL换 算 为g/mL的 换 算 系 数。计 算 结 果 保 留 三 位 有 效 数 字。7 精 密 度在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得
22、 超 过 算 术 平 均 值 的10%。8 其 他婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油,当 取 样 量 为1g,定 容5mL时,检 出 限 为1.5g/100g,定 量 限 为5g/100g;果 蔬 样 品 当 取 样 量 为5g,提 取 液 分 取5mL,定 容5mL时,检 出 限 为1.5g/100g,定 量 限为5g/100g。第 二 法 液 相 色 谱-串 联 质 谱 法9 原 理婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油 等 样 品 经 脂 肪 酶 和 淀 粉 酶 酶 解,用 正 己 烷 提 取 样 品 中 的 维 生 素K1后,用C 18液 相 色 谱 柱 将 维 生 素K1
23、与 其 他 杂 质 分 离,串 联 质 谱 检 测,同 位 素 内 标 法 定 量。水 果、蔬 菜 等 低 脂 性 植 物 样 品,用 异 丙 醇 和 正 己 烷 提 取 其 中 的 维 生 素K1,经 中 性 氧 化 铝 柱 净 化,去除 叶 绿 素 等 干 扰 物 质。用C 18液 相 色 谱 柱 将 维 生 素K1与 其 他 杂 质 分 离,串 联 质 谱 检 测,同 位 素 内 标 法定 量。1 0 试 剂 和 材 料除 非 另 有 说 明,本 方 法 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯,水 为GB/T6682规 定 的 一 级 水。1 0.1 试 剂1 0.1.1 无 水 乙 醇(C
24、H3CH2OH)。1 0.1.2 碳 酸 钾(K2CO3)。1 0.1.3 氢 氧 化 钾(KOH)。1 0.1.4 甲 酸(HCOOH):色 谱 纯。1 0.1.5 甲 酸 铵(HCOONH4):色 谱 纯。1 0.1.6 异 丙 醇(CH3)2CHOH。1 0.1.7 正 己 烷CH3(CH2)4CH3。1 0.1.8 甲 醇(CH3OH):色 谱 纯。1 0.1.9 乙 酸 乙 酯(C 4H8O2)。1 0.1.1 0 脂 肪 酶:酶 活 力700U/mg。1 0.1.1 1 淀 粉 酶:酶 活 力1.5U/mg。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 66 1 0.2 试 剂 配
25、 制1 0.2.1 40%氢 氧 化 钾 溶 液:称 取20g氢 氧 化 钾 于100mL烧 杯 中,用20mL水 溶 解,冷 却 后,加 水 至50mL,储 存 于 聚 乙 烯 瓶 中。1 0.2.2 磷 酸 盐 缓 冲 液(pH8.0):溶 解54.0g磷 酸 二 氢 钾 于300mL水 中,用40%氢 氧 化 钾 溶 液 调 节pH至8.0,加 水 至500mL。1 0.2.3 正 己 烷-乙 酸 乙 酯 混 合 液(90+10):量 取90mL正 己 烷,加 入10mL乙 酸 乙 酯,混 匀。1 0.2.4 流 动 相:1000mL甲 醇 中 加 入0.25mL甲 酸 和0.1575g
26、甲 酸 铵,超 声 溶 解 后,用0.22m有 机系 滤 膜 过 滤。1 0.3 标 准 品1 0.3.1 维 生 素K1(C 31H46O2,CAS号:84-80-0):纯 度99.3%。1 0.3.2 维 生 素K1-D7(C 31H46O2,CAS号:1233937-39-7):纯 度99.5%。1 0.4 标 准 溶 液 配 制1 0.4.1 维 生 素K1标 准 贮 备 溶 液(1mg/mL):准 确 称 取50mg(精 确 至0.1mg)维 生 素K1标 准 品 于50mL容 量 瓶 中,用 甲 醇 溶 解 并 定 容 至 刻 度。将 溶 液 转 移 至 棕 色 玻 璃 容 器 中
27、,在-20下 避 光 保 存,保存 期2个 月。标 准 储 备 液 在 使 用 前 需 要 进 行 浓 度 校 正,校 正 方 法 参 照 附 录A。1 0.4.2 维 生 素K1标 准 中 间 液(100g/mL):准 确 吸 取 维 生 素K1标 准 贮 备 溶 液10.00mL于100mL容 量 瓶 中,加 甲 醇 至 刻 度,摇 匀。将 溶 液 转 移 至 棕 色 玻 璃 容 器 中,在-20下 避 光 保 存,保 存 期2个 月。1 0.4.3 维 生 素K1标 准 使 用 液(1g/mL):准 确 吸 取 维 生 素K1标 准 中 间 液1.00mL于100mL容 量 瓶中,加 甲
28、 醇 至 刻 度,摇 匀。1 0.4.4 维 生 素K1-D7同 位 素 内 标 贮 备 溶 液(100g/mL):准 确 称 取1mg(精 确 至0.01mg)维 生 素K1-D7同 位 素 内 标,用 甲 醇 溶 解 并 定 容 至10mL。1 0.4.5 维 生 素K1-D7同 位 素 内 标 使 用 液(1g/mL):吸 取 维 生 素K1-D7同 位 素 内 标 贮 备 溶 液1.00mL于100mL容 量 瓶 中,加 甲 醇 至 刻 度,摇 匀。1 0.4.6 标 准 系 列 工 作 溶 液:分 别 准 确 吸 取 维 生 素K1标 准 使 用 液0.10mL、0.20mL、0.5
29、0mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL于10mL容 量 瓶 中,各 加 入 同 位 素 内 标 使 用 液0.50mL,加 甲 醇 定 容 至 刻度,此 标 准 系 列 工 作 液 维 生 素K1浓 度 分 别 为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。1 0.5 材 料1 0.5.1 中 性 氧 化 铝:粒 径50m150m。1 0.5.2 中 性 氧 化 铝 柱:2g/6mL,填 料 中 含10%水,可 直 接 购 买 商 品 柱,也 可 自 行 装 填。注:中 性 氧 化 铝 柱 装 填 方 法:a)填 料 处 理:
30、取200g中 性 氧 化 铝 于500mL的 广 口 瓶 中,于150干 燥 箱 中 烘 烤2h,加 盖 后 于 干 燥 器 中 冷却 至 室 温,缓 慢 加 入20mL纯 水,边 加 边 摇,加 完 后 加 上 瓶 盖,放 入80烘 箱 中3mi n5mi n,取 出 后,剧烈 振 摇,直 至 瓶 内 氧 化 铝 自 由 流 动,无 结 块,置 于 干 燥 器 中 冷 却30mi n,备 用。b)层 析 柱 装 填:取6mL的 针 筒 式 柱 套,加 入 筛 板,称 取2.00g上 述 经 脱 活 化 处 理 的 填 料,再 加 入 一 块 筛 板,用 装 填 工 具 压 紧。1 0.5.3
31、 微 孔 滤 头:带0.22m微 孔 滤 膜。1 1 仪 器 和 设 备1 1.1 液 相 色 谱-质 谱 联 用 仪:带 电 喷 雾 离 子 源(ES I)。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 67 1 1.2 匀 浆 机。1 1.3 高 速 粉 碎 机。1 1.4 组 织 捣 碎 机。1 1.5 涡 旋 振 荡 器。1 1.6 恒 温 水 浴 振 荡 器。1 1.7 pH计:精 度0.01。1 1.8 天 平:感 量1mg和0.1mg。1 1.9 离 心 机:转 速6000r/mi n。1 1.1 0 旋 转 蒸 发 仪。1 1.1 1 氮 吹 仪。1 1.1 2 超 声 波 振
32、 荡 器。1 2 分 析 步 骤1 2.1 试 样 制 备米 粉、奶 粉 等 粉 状 样 品 经 混 匀 后,直 接 取 样;片 状、颗 粒 状 样 品,经 样 本 粉 碎 机 磨 成 粉,储 存 于 样 品 袋中 备 用;液 态 乳、植 物 油 等 液 态 样 品 摇 匀 后,直 接 取 样;水 果、蔬 菜 等 取 可 食 部 分,水 洗 干 净,用 纱 布 擦 去表 面 水 分,经 匀 浆 器 匀 浆,储 存 于 样 品 瓶 中 备 用。制 样 后,需 尽 快 测 定。1 2.2 试 样 处 理警 示:处 理 过 程 应 避 免 紫 外 光 照,尽 可 能 避 光 操 作。1 2.2.1
33、婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油1 2.2.1.1 酶 解准 确 称 取 经 均 质 的 试 样1g5g(精 确 到0.01g,维 生 素K1含 量 不 低 于0.02g)于50mL离 心 管中,加 入 同 位 素 内 标 使 用 液(1g/mL)0.25mL,加 入5mL温 水 溶 解(液 体 样 品 直 接 吸 取5mL,植 物 油不 需 加 水 稀 释),加 入 磷 酸 盐 缓 冲 液(pH8.0)5mL,混 匀,加 入0.2g脂 肪 酶 和0.2g淀 粉 酶(不 含 淀 粉 的样 品 可 以 不 加 淀 粉 酶),加 盖,涡 旋2mi n3mi n,混 匀 后,置 于372恒
34、 温 水 浴 振 荡 器 中 振 荡2h以 上,使 其 充 分 酶 解。1 2.2.1.2 提 取取 出 酶 解 好 的 试 样,分 别 加 入10mL乙 醇 及1g碳 酸 钾,混 匀 后 加 入10mL正 己 烷,涡 旋 提 取10mi n,6000r/mi n离 心3mi n,转 移 上 清 液 至 另 一50mL离 心 管 中,向 下 层 液 再 加 入10mL正 己 烷,涡 旋5mi n,6000r/mi n离 心3mi n,合 并 上 清 液,正 己 烷 定 容 至25mL,待 净 化。1 2.2.1.3 净 化在 上 述 提 取 液 中 加 入20mL水,振 摇0.5mi n,静
35、置 分 层 后,分 取5mL上 清 液 于10mL的 玻 璃 试管 中,氮 吹 至 干,加 入1mL甲 醇 溶 解,用0.22m滤 膜 过 滤,滤 液 待 进 样。不 加 试 样,按 同 一 操 作 方 法 做 空 白 试 验。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 68 1 2.2.2 水 果、蔬 菜 样 品1 2.2.2.1 提 取准 确 称 取1g5g(精 确 到0.01g,维 生 素K1含 量 不 低 于0.02g)经 均 质 匀 浆 的 样 品 于50mL离心 管 中,加 入 同 位 素 内 标 使 用 液(1g/mL)0.25mL,加 入5mL异 丙 醇,涡 旋1mi n,超
36、 声5mi n,加 入10mL正 己 烷,涡 旋 振 荡 提 取3mi n,6000r/mi n离 心5mi n,移 取 上 清 液 于25mL棕 色 容 量 瓶 中,向 下层 溶 液 中 再 加 入10mL正 己 烷,重 复 提 取1次,合 并 上 清 液 于 上 述 容 量 瓶 中,正 己 烷 定 容 至 刻 度,用 移液 管 准 确 分 取 上 清 液5mL至10mL试 管 中,氮 气 轻 吹 至 干,加 入1mL正 己 烷 溶 解,待 净 化。1 2.2.2.2 净 化将 上 述1mL提 取 液 用 少 量 正 己 烷 转 移 至 预 先 用5mL正 己 烷 活 化 的 中 性 氧 化
37、 铝 柱 中,待 提 取 液 流至 近 干 时,5mL正 己 烷 淋 洗,6mL正 己 烷-乙 酸 乙 酯 混 合 液 洗 脱 至10mL试 管 中,氮 气 吹 干 后 加 入1mL甲 醇,过0.22m滤 膜,滤 液 供 分 析 测 定。不 加 试 样,按 同 一 操 作 方 法 做 空 白 试 验。1 2.3 色 谱 参 考 条 件a)色 谱 柱:C 18柱,柱 长50mm,内 径2.1mm,粒 径1.8m,或 具 同 等 性 能 的 色 谱 柱;b)流 动 相:甲 醇(含0.025%甲 酸+2.5mmo l/L甲 酸 铵);c)流 速:0.3mL/mi n;d)柱 温:30;e)进 样 量
38、:5L。1 2.4 质 谱 参 考 条 件a)电 离 方 式:ES I+;b)鞘 气 温 度:375;c)鞘 气 流 速:12L/mi n;d)喷 嘴 电 压:500V;e)雾 化 器 压 力:172kPa;f)毛 细 管 电 压:4500V;g)干 燥 气 温 度:325;h)干 燥 气 流 速:10L/mi n;i)多 反 应 监 测(MRM)模 式。锥 孔 电 压 和 碰 撞 能 量 见 表1,质 谱 图 见 附 录C。表1 M R M分 析 的 质 谱 参 数化 合 物 母 离 子(m/z)子 离 子(m/z)碰 撞 能 量/eV维 生 素K1 451187*2272322维 生 素K
39、1-D7 458178194*3023*为 定 量 离 子。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 69 1 2.5 标 准 曲 线 的 制 作将 标 准 系 列 工 作 溶 液 按 浓 度 由 低 到 高 注 入 液 相 色 谱-质 谱 仪 进 行 测 定,测 得 相 应 色 谱 峰 的 峰 面 积,以 标 准 系 列 工 作 溶 液 中 维 生 素K1的 浓 度 为 横 坐 标,维 生 素K1的 色 谱 峰 的 峰 面 积 与 同 位 素 内 标 色 谱 峰的 峰 面 积 的 比 值 为 纵 坐 标,绘 制 标 准 曲 线。1 2.6 试 样 溶 液 的 测 定将 试 样 溶 液 注
40、 入 液 相 色 谱-质 谱 仪 进 行 测 定,测 得 相 应 色 谱 峰 的 峰 面 积,根 据 标 准 曲 线 得 到 试 样 溶液 中 维 生 素K1的 浓 度。如 试 样 溶 液 中 维 生 素K1的 浓 度 超 出 线 性 范 围,则 需 适 当 减 少 取 样 量 按12.2处理 试 样 后 重 新 测 定。1 2.7 定 性试 样 中 目 标 化 合 物 色 谱 峰 的 保 留 时 间 与 标 准 色 谱 峰 的 保 留 时 间 相 比 较,变 化 范 围 应 在2.5%之 内。待 测 化 合 物 定 性 离 子 色 谱 峰 的 信 噪 比 应3,定 量 离 子 色 谱 峰 的
41、 信 噪 比 应10。每 种 化 合 物 的 质 谱 定 性 离 子 应 出 现,至 少 应 包 括 一 个 母 离 子 和 两 个 子 离 子,而 且 同 一 检 测 批 次,对同 一 化 合 物,样 品 中 目 标 化 合 物 的 两 个 子 离 子 的 相 对 丰 度 比 与 浓 度 相 当 的 标 准 溶 液 相 比,其 允 许 偏 差 不超 过 表2规 定 的 范 围。表2 定 性 时 相 对 离 子 丰 度 的 最 大 允 许 偏 差相 对 离 子 丰 度50%20%50%10%20%10%允 许 相 对 偏 差20%25%30%50%1 3 分 析 结 果 的 表 述试 样 中
42、维 生 素K1的 含 量 按 式(2)计 算:X=V1 V3 100m V2 1000(2)式 中:X 试 样 中 维 生 素K1的 含 量,单 位 为 微 克 每 百 克(g/100g);由 标 准 曲 线 得 到 的 试 样 溶 液 中 维 生 素K1的 浓 度,单 位 为 纳 克 每 毫 升(ng/mL);V1 提 取 液 总 体 积,单 位 为 毫 升(mL);V3 定 容 液 的 体 积,单 位 为 毫 升(mL);100 将 结 果 单 位 由g/g换 算 为g/100g样 品 中 含 量 的 换 算 系 数;m 试 样 的 称 样 量,单 位 为 克(g);V2 分 取 的 提
43、取 液 体 积,单 位 为 毫 升(mL);1000 将 浓 度 单 位 由ng/mL换 算 为g/mL的 换 算 系 数。计 算 结 果 保 留 三 位 有 效 数 字。1 4 精 密 度在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的10%。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 610 1 5 其 他婴 幼 儿 食 品 和 乳 品、植 物 油,当 取 样 量 为1g,提 取 液 分 取5mL,浓 缩 后 定 容1mL时,检 出 限 为1.5g/100g,定 量 限 为5g/100g;果 蔬 样 品 当
44、 取 样 量 为5g,提 取 液 分 取5mL,浓 缩 后 定 容1mL时,检 出 限 为0.3g/100g,定 量 限 为1g/100g。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 611 附 录 A维 生 素K 1标 准 浓 度 校 正 方 法 维 生 素K1标 准 溶 液 配 制 后 需 对 其 浓 度 进 行 校 正,具 体 操 作 如 下:取 维 生 素K1标 准 储 备 溶 液1.00mL,吹 干 甲 醇 后,用 正 己 烷 定 容 至100mL容 量 瓶 中,按 给 定 波 长 测 定 吸 光 值,以 正 己 烷 为 空 白,用1cm的 石 英 比 色 杯 在248nm波 长
45、下 测 定 吸 收 值,标 准 储 备 液 的 质 量 浓 度 按 式(A.1)计 算,测 定 条 件见 表A.1。表A.1 维 生 素K 1吸 光 值 的 测 定 条 件标 准 比 吸 光 系 数 波 长/nm维 生 素K1 419 248=A248 104100419(A.1)式 中:维 生 素K1标 准 储 备 液 浓 度,单 位 为 微 克 每 毫 升(g/mL);A248 标 准 校 正 测 试 液 在248nm波 长 下 的 吸 收 值;100 稀 释 因 子;419 在248nm波 长 下 的 百 分 吸 光 系 数E1%1cm,即 在248nm波 长 下,液 层 厚 度 为1c
46、m时,浓 度为1%的 维 生 素K1正 己 烷 溶 液 的 吸 光 度(系 数“419”同BSEN141482003和AOACOf f i c i a lMe t hod999.15)。G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 612 附 录 B高 效 液 相 色 谱 图 标 准 溶 液 中 维 生 素K1色 谱 图 见 图B.1。图B.1 1 0 0 n g/m L标 准 溶 液 中 维 生 素K 1色 谱 图G B 5 0 0 9.1 5 82 0 1 613 附 录 C质 谱 参 考 图C.1 维 生 素K1和 维 生 素K1-D7质 谱 扫 描 图 见 图C.1。图C.1 维 生 素K 1和 维 生 素K 1-D 7质 谱 扫 描 图C.2 标 准 溶 液 中 维 生 素K1和 维 生 素K1-D7的MRM谱 图 见 图C.2。图C.2 5 0 n g/m L标 准 溶 液 中 维 生 素K 1和 维 生 素K 1-D 7的M R M谱 图
