1、 生化组分的鉴定 一、 实验目的1) 了解常见生化组分鉴定的方法与意义。2) 掌握鉴定糖和蛋白质的原理与方法。3) 了解有关酶的特性。二、 实验原理1) 叶淀淀粉遇碘呈蓝色2) -淀粉酶-淀粉酶能将淀粉分子链中的 -1，4-葡萄糖苷键切断，使淀粉成为长短不一的短链糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖，因此酶反应过程中淀粉对碘呈蓝色的特异反应逐渐消失，同时出现单糖的还原性。3) 本尼迪特（Benedict）本尼迪特是极为含 Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或者酮基的糖氧化，其本身还原成红色或者黄色 Cu2O。此法常用作还原糖的定性或定量测定。 称取 85g 柠檬酸钠（Na3C6H3O711H2O）及
2、50g 无水碳酸钠，溶于 400ml 蒸馏水中。另溶解 8.5g硫酸铜于 50ml 热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。 4) 还原糖生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基） ，因此叫做还原糖。5) 蔗糖鉴定蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟基，因此为非还原性糖，不具有还原性。本实验中，用本尼迪特试剂只能检验生物组织中还原糖存在与否，而不能鉴定非还原性糖。6) 双缩脲反应双缩脲试剂的成分是质量浓度为 0.1 gmL 的氢氧化钠溶液和质量浓度为 0.01 gmL 的硫酸铜溶液。在碱
3、性溶液(NaOH)中，双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与 Cu2+作用，形成紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。7) 蛋白质鉴定由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。8) 茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及 -氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。最大吸收值的波长为 570nm 此反应为一切 a-氨基酸所共有。反应灵敏因，本法是氨基酸定量测定应用最广
4、泛的方法之一。蛋白质虽然具有茚三酮反应，但肽链越大灵敏度也越来越差，故不宜作定量测定。三、 实验器材仪器：点滴板、量筒、试管、烧杯、恒温水浴锅、试管夹、移液管、毛细管，吸水纸。试剂：1、稀碘液：配制 2%碘化钾溶液（KI） ，加入适量碘，使溶液呈棕黄色即可，储存于棕色瓶内。2、2%可溶性淀粉：称取 4.00g 可溶性淀粉，与少量冷蒸馏水混合成薄浆状，然后加入沸蒸馏水，边加边搅拌，最后定容至 200ml，此溶液当天配当天使用。3、0.02mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）45.23g，柠檬酸（C6H 8O 7H 2O）8.07g。用 90
5、0ml 蒸馏水溶解，调 pH 至 6.0，然后定容至 1000ml。4、本尼迪特试剂：称取 85g 柠檬酸钠（Na3C6H3O711H2O）及 50g 无水碳酸钠，溶于 400ml 蒸馏水中。另溶解 8.5g 硫酸铜于 50ml 热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。5、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖 3g，溶于蒸馏水并定容至 300ml。6、-淀粉酶酶粉。称取酶粉 10-15mg，用 0.02mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，然后定容至 50ml 备用。7、牛血清白蛋白（BSA） 。称取牛血清白蛋白 100mg，用 0.02mol/L
6、 pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，然后定容到 50ml 备用。8、0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于 95%乙醇并稀释至 100ml。9、10%NaOH 溶液：10gNaOH 溶于蒸馏水。稀释至 100ml。10、1%硫酸铜溶液：硫酸铜 1g 溶于蒸馏水，稀释至 100ml。四、 方法与步骤 1) 在白色滴板的空穴内各加 5-6 滴稀碘液。先用滴管取数滴 2%可溶性淀粉溶液于盛有稀碘液的滴板孔内，观察其颜色变化，2) 在试管内，加入 5ml 2%可溶性淀粉溶液和 2ml 0.02mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在 60恒温水浴中预热 5min。加入上述配制好的
7、酶液 0.5ml，不断搅拌，每隔 1 分钟用滴管取数滴于盛有稀碘液的滴板孔内，观察其颜色变化。3) 取上述反应液 3 滴于 1 支试管中，然后加入本尼迪特试剂 2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察结果。4) 另取 1 支试管，加入 1%葡萄糖溶液 1ml，然后加入本尼迪特试剂 2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察结果。5) 蛋白质双缩脲试验：取一试管，加蛋白质溶液 10 滴，再加 10%NaOH 溶液 10 滴及1%硫酸铜溶液 2 滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。6) 蛋白质茚三酮反应：取 1ml 蛋白质溶液置于试管中，加 2 滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。 （此反须在 pH5-7 进行） 。另取，奶粉的溶液做 5、6 的测定。五、 实验结果六、 实验结论1) 淀粉的检验用碘液。2) 还原性糖类的鉴定根据其中醛基或酮基与铜离子反应显色，出现砖红色来鉴定。3) 蛋白质的鉴定根据其与双缩脲反应呈紫玫瑰色，或与茚三酮反应呈蓝紫色来鉴定。七、 问题解答有什么注意事项？1) 鉴定淀粉时碘液不要太多，淀粉溶液不宜太浓。2) 酶反应过程中不断取样检验，注意恒温水浴。3) 使用双缩脲试剂时要注意碱性环境以及硫酸铜要少量。4) 茚三酮试剂的量要控制好，加热时间要足够才有变色反应。
