WS 216—2018登革热诊断.pdf

1、ICS 11.020 C 59 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生 行 业 标 准 WS 216 2018 代替 WS 216 2008 登革热诊 断 Diagnosis for dengue fever 2018-03-06 发布 2018-08-01 实施 中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会 发布 WS 216 2018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术 语和 定义.1 3 诊 断依 据.1 4 诊 断原 则.2 5 诊断.2 6 鉴 别诊 断.2 附录A（规 范性 附录）登革热 血清 学检 测方 法.3 附录B（规 范性 附录）登革

2、热 病原 学检 测方 法.10 附录C（资 料性 附录）登革热 的鉴 别诊 断.16 附录D（资 料性 附录）登革热 的病 原学、流 行病 学及临 床表 现.18 参考文 献.21 WS 216 2018 II 前 言 本标准 第5 章为 强制 性条 款,其余 为推 荐性 条款。本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 代替WS 216 2008 登革 热诊 断标 准。本标准 与WS 216 2008 相 比，主 要技术 变 化如 下：修 改了 适用 范围（见 第1章，2008 年 版的 第1章）；术 语和 定义 删除 了束 臂试验，增 加了 重症 登革 热和NS1

3、抗原（见 第2章，2008年版 的 第2 章）；修 改了 临床 表现（见 第3章，2008年版 的3.2）；修 改了 实验 室检 查（见 第3 章，2008 年版 的3.3）；删 除了“血 液浓 缩；低白蛋 白血 症”指标（见2008 年 版的3.3.3）；增加 了“发 病5d 内的 登革病 毒NS1 抗 原检 测阳 性”指标（见 第3 章，2008 年 版的3.3）；修 改了 疑似 病例（见 第5章，2008年版 的5.1）；修 改了 临床 诊断 病例（见第5章，2008 年 版的5.2）；修 改了 确诊 病例（见 第5章，2008 年 版的5.3）；增 加了 重症 病例（见 第5章，200

4、8 年 版的 的5.4）；调 整了 附录A和 附录B 的顺序；附录A 中增 加了“酶联 免疫法 检测 登革 病毒NS1 抗 原”方法，删 除了 原有 的“血凝 抑制（HI）试验检测 登革 病毒 血凝 抑制 抗体”方法（见 附录A和附录B，2008 年版 的附录A和 附录B）；修 改了 附录D中 内容，将原有 的“登 革出 血热”和“登 革休克 综合 征”改 为“重 症登革 热”，将重症 登革 热的 高危 人群 和早期 识别 重症 病例 的预 警指征 纳入（见 附录D，第5 章，2008 年 版的 附录D）。本标准 起草 单位：广东 省 疾病预 防控 制中 心、广 州 市第八 人民 医院、中国

5、疾 病预防 控制 中心 病毒 病预防控 制所、中国 疾病 预 防控制 中心、首都 医科 大 学附属 北京 地坛 医院、中 国军事 医学 科学 院微 生物 流行病研 究所。本标准 主要起 草人：何剑 峰、张 复春、王世 文、殷 文武、李建东、李 兴旺、秦成峰、王 建、吴 德、邓爱萍。本标准 所代 替标 准的 历次 版本发 布情 况为：WS 216 2001；WS 216 2008。WS 216 2018 1 登 革热诊 断 1 范围 本标准 规定 了登 革热 的诊 断 依据、诊 断原 则、诊断 和鉴别 诊断。本标准 适用 于各 级各 类医 疗 卫生 机构 及 其 医务 人员 对于登 革热 病例

6、的诊 断。2 术语和 定义 下列 术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 重症登 革热 severe dengue 登革热 的一 种严 重类 型，临床表 现为 严重 出血、休 克、严 重脏 器损 伤等。2.2 NS1 抗原 NS1 antigen 登革病 毒非 结构 蛋白 中的 一种糖 蛋白，其 大量 存在 于感染 细胞 的表 面，可作 为早期 诊断 的特 异 性 指标。3 诊断依 据 3.1 流行病 学史 发病 前 14d 内，曾经 到 过 登 革热流 行区，或 居住 场所 或 工作场 所周 围 1 个月 内 曾 出现过 登革 热病 例。3.2 临床表 现 3.2.1 急性起 病，突 发

7、高热，明 显疲乏、厌 食、恶心 等，常 伴有 较 剧烈 的头 痛、眼眶 痛、全 身肌 肉痛、骨关节 痛等 症状，可 伴面 部、颈 部、胸部 潮红，结 膜充血 等。3.2.2 皮疹：于病 程 第 3 天 第6 天在 颜面 四肢 出现 充血 性皮疹 或点 状出 血疹。典 型皮疹 为见 于四 肢的针尖 样出 血点 及“皮岛”样表 现等。皮 疹分 布于 四肢躯 干或 头面 部，多有 痒感，不脱 屑。持 续 3 d 5 d。3.2.3 出血倾 向：部分 病人 可出 现不同 程度 的出 血表 现，如皮下 出血、注 射部 位瘀 点、牙 龈出 血、鼻衄及束 臂试 验阳 性等。3.2.4 严重出 血：皮下 血肿

8、，肉 眼血尿，消 化道、胸 腹腔、阴道、颅 内等 部位 出血。3.2.5 严重脏 器损 伤：急性 心肌 炎、急 性呼 吸窘 迫综 合征、急性 肝损 伤、急性 肾功 能不全、中 枢神 经系统损 伤等 表现。WS 216 2018 2 3.2.6 休克：心动 过速、肢 端湿 冷、毛 细血 管充 盈时 间延 长 3s、脉 搏细 弱或 测不 到、脉 压差 减小 或血压测 不到 等。3.3 实验室 检查 3.3.1 白细胞 计数 减少 和/或血 小 板减少。3.3.2 登革病 毒IgM 抗 体阳 性（见附 录A 中 A.1、A.2）。3.3.3 发病 5d 内 的登 革病毒 NS1 抗原检 测阳 性（见

9、 A.3）。3.3.4 登革病 毒 恢 复期 血清 特异 性 IgG 抗体 滴度 比急 性 期有 4 倍及 以上 增长 或阳 转（见A.4、A.5）。3.3.5 从急性 期病 人血 液、脑脊 液或组 织等 中分 离到 登革 病毒（见附 录 B 中B.1、B.2）。3.3.6 应用 RT-PCR 或 实时 荧光 定 量RT-PCR 检出 登革 病毒 核 酸（见 B.3、B.4）。4 诊断原 则 依据患 者的 流行 病学 证据、临床 表现 及实 验室 检查 结果进 行综 合判 断。5 诊断 5.1 疑似病 例 符合下 列一项 可 诊断 为疑 似病例：a)符合3.1，并同时 符合 3.2.1。b)同

10、时符合 3.2.1、3.3.1。5.2 临床诊 断病 例 符合下 列一项 可 诊断 为临 床诊断 病例：a)符合5.1a），并同时 符合3.2.2、3.2.3 中任 一项 和3.3.1。b)符合5.1，并 同时 符合 3.3.2、3.3.3 中任 一项。5.3 确诊病 例 符合5.1 或5.2，并同 时符 合3.3.4、3.3.5、3.3.6 中 任一项 可诊 断为 确诊 病例。5.4 重症登 革热 符合5.2 或5.3，并同 时符 合3.2.4、3.2.5、3.2.6 中 任一项 可诊 断重 症登 革热。6 鉴别诊 断 登革热 应与 麻疹、风 疹、猩红热、流 行性 感冒、基 孔肯雅 热、寨卡

11、 病毒 病相 鉴别；重症 登革 热应 与钩端螺 旋体 病、肾综 合征 出血热、恙 虫病 等相 鉴别。参见 附录C与 附录D。WS 216 2018 3 A A 附 录 A（规范 性附 录）登革热 血清 学检 测方 法 A.1 应用IgM 捕 捉酶 联免 疫吸 附 试验（Mac-ELISA）检测 登 革病毒IgM 抗体 A.1.1 原理 根据抗 原抗体 特异 性结合 的原理，利用 抗人 链单 克隆抗 体捕获 待检 测血清 中的IgM，再 加入 特 异性抗原 和相 应酶 标单 克隆 抗体，加底 物显 色。显色 程度与 特异 性IgM 抗 体含 量 呈正相 关。A.1.2 材料和 试剂 所需材 料

12、和 试剂 如下：a)洗板机、酶 标仪、恒 温温 箱或水 浴箱（37 2）；b)10L 100 L 可调 移液 器、10mL 吸管；c)稀释血 清用 的试 管、吸水 纸；d)蒸馏水 或去 离子 水；e)登革病 毒IgM 抗 体捕 捉ELISA 诊 断试 剂盒。A.1.3 检测方 法 具体步 骤如 下：a)在一系 列试 管中，将 阴、阳性对 照血 清，临界 值较 准血清 和待 检血 清稀 释 成1100；b)吸 取 所 需 量的 纯 化 登革 病毒 抗 原 和 等体 积 辣 根过 氧化 物 酶 标 记单 克 隆 抗体 至另 一 干 净 的玻 璃瓶或试 管中，混 匀后 置室 温作 用 1h；c)混合

13、好 标记 单克 隆抗 体和 抗原后，在 10min 内 各吸 取 100 L 稀释 好的 病人 标 本和对 照血 清 至测试板 上相 应的 微孔 中，37 作 用1h；d)弃血清，用 洗涤 液重 复洗 涤 6 次，吸 水纸 上扣 干，分别 加 100 L 上述 作用 好 的登革 病毒 抗 原和酶标 单克 隆抗 体复 合物，37作用 1h；e)弃登革 病毒 抗原 和酶 标单 克隆抗 体复 合物，用洗 涤 液重复 洗 涤 6 次，吸水 纸 上扣干，每孔 加入100L 的 TMB（四甲 基联 苯胺），室 温作 用10min 充分显 现蓝 色后，每 孔加 入 100 L 的终止液，混 匀；f)在30m

14、in 内于 450nm 波长 处读取 每孔 的吸 光度。A.1.4 结果判 断 A.1.4.1 酶标仪 读数 结果 判断 判断标 准为：在NC/CO 1 且PC/CO 1 的情 况下，若S/CO 0.9，则结 果为 阴性，若S/CO 1.1，则 结果为阳 性，若S/CO 0.9 1.1，则标 本需 重做。注：S 为 待检 血 清 的吸 光 度；NC 为 阴性 对 照 血 清的 吸 光 度；PC 为阳性 对 照 血 清的 吸 光 度；CO 为临界 较 准 血 清的 吸 光度平均值。A.1.4.2 目测法 WS 216 2018 4 未加终 止液 前，在 阳性 对 照血清 为深 蓝色、阴性 对 照

15、血清 为无 色的 情况 下，若样品 孔的 颜色 比临 界较准血 清孔 深者 为阳 性，样品孔 的颜 色比 临界 较准 血清孔 浅者 为阴 性。A.1.5 意义 IgM 抗 体阳 性，表示 患者 新 近感染 登革 病毒，适 用于 登革 热 早期 诊断。A.2 应用间 接酶 联免 疫吸 附试 验（ELISA）检 测登 革病 毒IgM抗体 A.2.1 原理 根据抗 原抗 体特 异性 结合 的原理，用 纯化 的登 革病 毒基因 工程 表达 抗原 包被 塑料板，与 稀释 的 待 检血清中 的特 异性 抗体 结合，其中 血清IgM 部分 又与 后 加入的 酶标 记的 抗人IgM 结 合，通 过酶 与底 物

16、的 作用产生可 见的 颜色 反应，显 色程度 与特 异性IgM 抗体 含 量呈正 相关。A.2.2 材料和 试剂 所需材 料和 试剂 如下：a)洗板机、酶 标仪、恒 温温 箱或水 浴箱（37 2）；b)10L 100 L 可调 移液 器、10mL 吸管；c)稀释血 清用 的试 管、吸水 纸；d)蒸馏水 或去 离子 水；e)登革病 毒IgM 抗体 酶联 免 疫诊断 试剂 盒。A.2.3 检测步 骤 具体步 骤如 下：a)将检测 血清 用样 品稀 释液 做 150 稀 释。（先 将 10 L 血 清加 入到 90 L 的 样品稀 释液 中 混匀，再将1 10 的 稀释 血清 用样品 稀释 液 做1

17、5 稀 释 充分混 匀。标 本稀 释后 应 在2h 内使 用。）b)将浓缩 洗涤 液加 入 720mL（96T）蒸 馏水 中混 匀备 用。c)取出已 包被 板，加 入已 稀 释血 清 100 L/孔，同 时 设阴、阳性 对照及 空白 对 照各 2 孔（阴、阳性对照 孔分 别直 接加 入相 应对照 血 清 100 L/孔，空白对 照加 入洗 涤液 100 L/孔），振 荡 均匀后，于 37 水浴 箱温 育40min。d)温育后，甩 去板 内液 体，用洗涤 液注 满各 孔，静 置1min 后甩 干，重复 洗涤5 次，扣 干。e)加入酶 标记 物 50 L/孔（空白孔 不加），振荡 均匀 后，于37

18、 水 浴箱 温育 30min。f)温育后，甩 去板 内液 体，用洗涤 液注 满各 孔，静 置1min 后甩 干，重复 洗涤5 次，扣 干。g)每孔加 入底 物 A、B 液各 50 L，37 避光 显 色 10min，再 加入 终止 液 50 L/孔，于 450nm 测OD 值。A.2.4 结果判 断 临界值（cut-off）=0.2+阴性对 照均 值（N 0.05 时，按0.05 计算）。样品OD 值大 于临 界值 为阳 性，样 品OD 值小 于临 界值 为阴性。样 品OD 值在 临界 值正负10 范围 内 为 可疑，建 议用 其他 方法 复试。A.2.5 意义 IgM 抗 体阳 性，表示 患

19、者 新 近感染 登革 病毒，适 用于 登革 热 早期 诊断。WS 216 2018 5 A.3 酶联免 疫法 检测 登革 病毒NS1 抗 原方 法 A.3.1 原理 在微孔 条上预 包被 登革病 毒的单 克隆抗 体，该抗体 可与登 革热病 例血 清中的 登革病 毒中的NS1 抗原特异性 结合，再 与辣 根过 氧化酶 标记 抗NS1 抗 体试 剂 进行第 二次 温育，当 样品 中存在 登革 病毒NS1 抗原 时将形成“包被 抗体-NS1-酶 标抗体”复合 物。加入显 色剂，复合物 上连 接的辣 根过氧 化物酶 催化 显示 剂反应，生成 蓝色 产物，终 止反应 后，变为 黄色，若 样品中 无登 革

20、病 毒NS1 抗 原 则不显 示。A.3.2 材料 10 L，100 L，200 L，1mL 移 液器 各一 把；温 箱一 台，洗 板机 一台，酶标 仪 一台。稀释 血清 用的试管、吸水 纸；蒸馏 水或 去离子 水；登革 病毒NS1 抗 原酶联 免疫 诊断 试剂 盒。A.3.3 检测步 骤 具体步骤 如 下：a)将试剂 盒在 冰箱 中取 出，放置室 温平 衡 30min，使 用前将 试剂 轻轻 振荡 混匀；b)配液：将试 剂盒 中浓 缩洗 涤液用 蒸馏 水 20 倍 稀释；c)编号：将样 品对 应微 孔板 编号，每板 设阴 性对 照 3 孔，阳 性对 照 2 孔和 空白 对照1 孔；d)加稀释

21、 液：每孔 加稀 释 液50L，空 白孔 除外；e)加样：分别 在相 应孔 加入 待测样 品或 阴阳 性对 照 各50L，空 白孔 除外；f)温育：用封 板膜 封板 后，置 37 温 育 60min；g)每孔加 酶标 试 剂 50L，空 白孔除 外，轻轻 振荡 混匀；h)温育：用封 板膜 封板 后，置 37 温 育 30min；i)洗板：小心 揭掉 封板 膜，用洗板 机洗 涤 5 遍，最 后1 次尽 量扣 干；j)显色：每孔 加入 显色 剂 A、B 液各 50L，轻 轻振荡混匀，37 避光 显 色 15min；k)测定：每孔 加终 止液 50L，10min 内 测定 结果。设 定酶标 仪波 长

22、于 450nm 处 建议 使用 双 波长450nm/（600 650）nm 检测，用 空白 孔调 零后 测定各 孔 A 值。A.3.4 结果判 定 临界值 计算：临 界值=0.10+阴性 对照 孔A 值 均值（阴 性对照 孔A 值低 于0.05者以0.05 计 算）。阴性对 照的正 常值 范围：阴性对 照孔A 0.1（若1 孔A0.1 应舍弃，若 两孔或 两孔以 上阴性 对照 0.1，应重 复实 验）。阳性对 照正 常值 范围：A 0.8。阳性判 定：样品A值 临 界 值者为 登革 病毒 抗原 阳性。阴性判 定：样品A值 临 界 值者为 登革 病毒 抗原 阴性。A.3.5 意义 阳性结 果 表

23、 示患 者新 近存在 登革 病毒 感染，适 用于 登革热 早期 诊断。A.4 用免疫 荧光 法（FA/IFA）检测 登 革病 毒IgG抗体 A.4.1 原理 WS 216 2018 6 某些荧 光素（常 用异 硫氰 酸荧光 素）能与 抗体 蛋白 分子结 合，而不 丧失 抗体 活力，仍能 和相 应 的 抗原发生 特异 免疫 反应，产生 免疫复 合物，这种 复合 物由 于有荧 光色 素的 参与，在荧 光显微 镜下 显示 荧 光，表明有 特异 性抗 原存 在。直接免 疫荧 光法 可用 于检 测感染 细胞 内的 特异 性抗 原，间 接免 疫荧 光 法 可 查 待检血清 中的 特异 性抗 体。A.4.2

24、 仪器与 试剂 所需仪 器与 试剂 如下：a)10L 100 L，100 L 1000L 可 调移 液器 各 1 支；b)登革病 毒14 型 抗原 片（登革标 准毒 株感 染BHK、Vero 或 C6/36 细 胞制 备，低温干 燥保 存）及相应 单克 隆抗 体（阳性 对照）、阴 性血 清；c)羊抗人（兔 抗人）IgG 荧 光抗体；d)待检患 者血 清（急性 期和 恢复期）；e)常用稀 释液：pH7.2 7.4PBS、伊 文斯 兰、封片 胶等；f)荧光显 微镜。A.4.3 检测步 骤 具体步 骤如 下：a)取出抗 原片，冷 风吹 干；b)用pH7.2 7.4PBS 稀 释待 检血清，从 120

25、 开 始，对倍稀 释至 所需 稀释 度；c)用 移 液 器依 次 从高 稀 释度向 低 稀 释度 逐 个加 入 稀释的 待 检 血清 于 四个 型 的登革 病 毒 抗原 片 孔中，每型 各加2 孔 待检 系列 稀释血 清，血 清量 以完 全覆 盖抗原 面而 不溢 出孔 外为 准，置湿 盒内，在37 水 浴孵 育 30min（每次试 验同 时作 阴、阳性 对照）；d)用pH7.2 7.4PBS 漂洗 3 次，每 次 约 30s 1min，再用蒸 馏水 洗 1 次，冷风 吹干；e)用pH7.2 7.4PBS 稀 释荧 光抗体，使其内 含 2 个工 作单位 和 1 8000 伊 文斯 兰的荧 光抗

26、体，加入各孔 中，使完 全覆 盖抗 原面，置湿 盒中，37 水 浴作 用30min，取出，同 上漂洗 及吹 干；f)用封片 胶（或甘 油缓 冲液）封片，荧 光显 微镜 观察 结果。A.4.4 结果判 断 特异性 荧光 呈黄 绿色 颗粒，分布 在感 染细 胞浆 中。根 据荧光 亮度 和阳 性细 胞在 细胞总 数中 所占 的 比例可将 荧光反 应大 致区分 为“+”，无 荧光 者 为“”。检 测抗 体滴度 时，以 特异荧 光达“+”最高血 清稀 释度 的倒 数表 示。A.4.5 意义 阳性 结 果只能 说明 受检者 可能曾 存在 登 革病 毒感染，但血 清抗体 效价 达180或以上 者有诊 断参

27、考意义，若恢 复期 血清 抗体 效价比 急性 期血 清抗 体效 价有4 倍或 以上 增长 可确 诊 最近存在 登 革病 毒感 染。A.5 中和试 验（NT）A.5.1 原理 当人体 感染 登革 病毒 后，血清中 可产 生保 护性 的中 和抗体，登革 病毒 与这 种 特异性 抗体 作用 后，能被特异 性地“中和”，抑 制登革 病毒的 复制 与繁殖，使其 失去感 染能 力。中 和试验 包括动 物中 和试 验、WS 216 2018 7 组织培 养中 和试 验和 空斑 减少中 和试 验三 种，每种 中 和试验 又分 为固 定病 毒稀 释血清 法和 固定 血清 稀 释病毒法 两种。动物中 和试 验由

28、于需 要特 殊的感 染动 物房，一 般的 实验室 很难 做到，所 以更 多的实 验室 采用 的 是 组织培养 中和 试验 和空 斑减 少中和 试验，其中 空斑 减 少中和 试验 比组 织培 养中 和试验 更敏 感、特 异，但 由于前者 对操 作技 术的 要求 更高，而且 病毒 噬斑 小，出斑时 间长，对 细胞 覆盖 培养基 的要 求也 高，故 一 般实验室 多用 的是 组织 培养 中和试 验。A.5.2 仪器与 试剂 所需仪 器与 试剂 如下：a)50L 200 L、1mL 可 调 移液器，200 L、1mL 无 菌吸头；b)无菌细 胞吹 打管、吸 管；c)无菌平 底微 量 96 孔 组织 培

29、 养板；d)无菌1.5mL 塑 料离 心管、冰盒；e)登革病 毒1 4 型标 准毒 株、C6/36 细 胞、阳性 和阴 性对照 血清；f)CO2 培养 箱、生物 安全 柜、倒置显 微镜；g)生长液（200mL）：Eagles MEM 溶液174mL，3 谷 氨 酰胺2mL，1 万 单位 青链 霉 素2mL，7.5 碳酸氢 钠2mL，新生 小牛 血清 20mL，临 用前 配制 混 匀；h)维持液 的配 制（200mL）：Eagles MEM 溶液 190mL，3 谷氨 酰 胺 2mL，1 万单 位 青链霉 素 2mL，7.5 碳酸 氢钠2mL，新 生 小牛血 清 4mL，临用 前配 制混匀。A.

30、5.3 检测步 骤 A.5.3.1 病毒滴 度测定 具体步 骤如 下：a)病毒悬 液制 备与 保存：将 新鲜传 代收 获的 登革 病 毒 14 型标 准毒 株的 组织 培 养病毒 悬液 或 乳小白鼠 脑组 织制 备的 病毒 悬液，经离 心沉 淀后 吸出 上清液，加 入 20 无 抗体 小牛血 清后 分装于细胞 冻存 管，迅速 放入 70 以下 冰箱 保存。b)病毒接 种：每型 登革 病毒 各取 出 1 小 管冰 冻的 病毒，在 冷水中 迅速 溶化，用 维 持液将 各型 病 毒分别 做 10 倍稀 释，从 10-2到 10-7，用 无菌 1.5mL 塑 料离心 管 在 冰 盒 上 进 行。每 个

31、 稀 释 度 病 毒加4 孔，每孔 加 50 L，然 后每孔 加 入 C6/36 细 胞（浓度 为1 106/mL）50 L，置 CO2 培养 箱内培养，温 度 33，湿度80。每 天 观察 细胞 病变，共观 察 7d，记录 观察 结 果。c)TCID50 的 计算：根 据细 胞病 变计 算 TCID50，见表A.1。表A.1 TCID50 的 计算 病毒稀释度 细胞病变孔数/接种数 细胞病变分布 累计 比数 细胞病变百分比%（）孔（）孔（）孔（）孔 10-3 4/4 4 0 9 0 9/9 100 10-4 3/4 3 1 5 1 5/6 83 10-5 2/4 2 2 2 3 2/5 40

32、 10-6 0/4 0 4 0 7 0/7 0 WS 216 2018 8 在这个 例子 中，能 引起50的组 织培 养板 出现 细胞 病变的 病毒 稀释 度在10-5和10-6之 间，计算 如下：距离比 例=（高于50%的 细 胞病变 百分 数-50）（高 于50%的细 胞病 变百 分数-低于50%的 细胞 病变 百分数）=（83-50）（83-40）=0.7 距离比 例与 高于50%细胞 病 变稀释 度的 对数 相加 即为TCID50（10-4.7）。由此 得出100TCID50 为10-2.7。A.5.3.2 组织培 养中 和试 验（固定 病毒稀 释血 清法）具体步 骤如 下：a)将待测

33、 血清 做系 列倍 比稀 释，12，14，1 8，1 16，1 32 根据 估计 的血清 效价 决 定稀释倍 数，用无 菌 1.5mL 塑料离 心管 在冰 盒上 进行。b)将上述 测定 好的 病毒 稀释 成 100TCID50/0.2mL，用无 菌1.5mL 塑料 离心 管在 冰 盒上进 行。c)将稀释 好的 血清 与稀 释好 的病毒 悬液 各取 等量 混匀，用 无菌1.5mL 塑 料离 心 管在冰 盒上 进行，置37 水 浴中 作用 1h。d)在平底 微 量 96 孔组 织培 养 板上，每个 稀释 度病 毒 加4 孔，每孔 加 50 L，然 后 每孔加 入 C6/36细胞（浓度 为 1 10

34、6/mL）50L，置 CO2 培 养箱 内培 养，温 度 33，湿度 80。每 天 观察细胞病变，共 观 察 7d，记 录 观察结 果。e)50血 清中 和终 点的 计算。根据 细胞 病变 计 算 50 血清中 和终 点，即能 保 护 50组 织培 养管不产生 病变 的血 清稀 释度，计算 方法 见 表 A.2。表A.2 50 血 清中 和终 点的 计算 血清 稀释度 细胞病变孔数/接种数 细胞病变分布 累计 比数 百分比%（）孔（）孔（）孔（）孔 1 4（10-0.6）0/4 0 4 0 16 0/16 0 1 8（10-0.9）0/4 0 4 0 12 0/12 0 1 1 6（10-1.

35、2）0/4 0 4 0 8 0/8 0 1 3 2（10-1.5）1/4 1 3 1 4 1/5 20 1 6 4（10-1.8）3/4 3 1 4 1 4/5 80 1 1 2 8（10-2.1）4/4 4 0 8 0 8/8 100 上述例 子能 保护50 的组 织培养 细胞 孔不 致细 胞病 变的血 清稀 释度 在1 32 1 64 之间，具 体计 算如下：距离比 例（50 低 于50 的 病变 率）（高于50的病 变率 低 于50 的 病变率）（50 20）（80 20）30600.5 低于50 病 变率 血清 稀释 度的对 数 距离 比例 乘稀 释系数 的对 数 1.5 0.5（0.

36、3）=1.5（0.15）=1.65，1.65 的反 对数 1/45 即145 的 血清 可保 护50 细胞不 产生 病变。A.5.4 意义 中和试 验是 登革 病毒 血清 学诊断 上最 特异、最 敏感 的方法。既 往感 染过 登革 病毒的 人在 检测 不到HI抗体时 也可 检出 中和 抗体。初次 感染 登革 病毒 可用 中和试 验进 行登 革病 毒四 种血清 型别 区分 鉴 定。恢 复期血清 中可 见到 相应 的单 一型别 反应。第 二或 第三 次感染，不 能用 中和 试验 进行血 清型 别鉴 定。WS 216 2018 9 A.6 应用间 接酶 联免 疫吸 附试 验（ELISA）检 测登 革

37、病 毒IgG抗体 A.6.1 原理 根据抗 原抗 体特 异性 结合 的原理，用 纯化 的登 革病 毒基因 工程 表达 抗原 包被 塑料板，与 稀释 的 待 检血清中 的特 异性 抗体 结合，其中 血清IgG 部分 又与 后 加入的 酶标 记的 抗人IgG 结 合，通 过酶 与底 物的 作用产生可 见的 颜色 反应，显 色程度 与特 异性IgG 抗体 含 量呈正 相关。A.6.2 材料与 试剂 所需材 料与 试剂 如下：a)洗板机、酶 标仪、恒 温温 箱或水 浴箱（37 2）；b)10L 100 L 可调 移液 器、10mL 吸管；c)稀释血 清用 的试 管、吸水 纸；d)蒸馏水 或去 离子 水

38、；e)登革病 毒IgG 抗 体酶 联免 疫诊断 试剂 盒。A.6.3 检测步 骤 具体步 骤如 下：a)将检测 血清 用样 品稀 释液 做150 稀释。（先将10L 血清加 入到90 L 的样 品 稀释液 中混 匀，再将1 10 的稀 释血 清用 样品稀 释液 做 1 5 稀释 充 分混匀，标 本稀 释后 应 在2h 内 使用）。b)将浓缩 洗涤 液加 入 720mL（96T）蒸 馏水 中混 匀备 用。c)取出已 包被 板，加入 已稀 释血 清 100 L/孔，同 时 设阴、阳性 对照 及空 白对 照各 2 孔（阴、阳性对 照孔 分别 直接 加入 相应对 照血 清 100 L/孔，空白 对照

39、加入 洗涤 液 100 L/孔），振 荡均匀后，于 37 水 浴箱 温 育40min。d)温育后，甩 去板 内液 体，用洗涤 液注 满各 孔，静 置1min 后甩 干，重复 洗涤5 次，扣 干。e)加入酶 标记 物 50 L/孔（空白孔 不加），振荡 均匀 后，于37 水 浴箱 温育30min。f)温育后，甩 去板 内液 体，用洗涤 液注 满各 孔，静 置1min 后甩 干，重复 洗涤5 次，扣 干。g)每孔加 入底 物 A、B 液各 50 L，37 避光 显 色 10min，再 加入 终止 液 50 L/孔，于 450nm 测OD 值。A.6.4 结果判 断 临界值（cut-off）=0.1

40、50+阴性 对照 均值（N0.05 时，按0.05 计算）。样品OD 值大 于临 界值 为阳 性，样 品OD 值小 于临 界值 为阴性。样 品OD 值在 临界 值正负10 范围 内 为 可疑，建 议用 其他 方法 复试。A.6.5 意义 病人 恢 复期 血清 比急 性期 血清IgG 抗 体滴 度有4 倍 及 以上升 高，可确 诊感 染，单 份血清 检测 一般 表 明其曾存在 登 革病 毒感 染，但抗体 滴度 大于 等于1320 时，结 合临 床表 现及 流行 病学史，亦可 确定 为新 近存在病 毒感 染。WS 216 2018 10 B B 附 录 B（规范 性附 录）登革热 病原 学检 测方

41、 法 B.1 C6/36 白纹 伊蚊 细胞 分离 登革病 毒 B.1.1 原理 登革病 毒是一 种具 有严格 的细胞 内存活 的生 物，必 须生活 在活的 细胞 组织内，C6/36 白纹 伊蚊 细 胞对登革 病毒 十分 敏感，根 据观察 病毒 对其 产生 的变 化（病 变等 现象）和 应用 特异、敏感 的检 测 技 术，检出病毒 的存 在和 型别。B.1.2 仪器与 试剂 所需 仪 器与 试剂 如下：a)50 L 200 L、1mL 可 调移液 器，200 L、1mL 无菌吸 头；b)无菌细 胞吹 打管、吸 管；c)无菌平 底微 量 96 孔/24 孔 组织培 养板 或细 胞管；d)C6/36

42、 细胞；e)CO2 培养 箱、生物 安全 柜、倒置显 微镜；f)生长液（200mL）：Eagles MEM 溶液174mL，3 谷氨 酰胺2mL，1 万单 位青 链霉 素2mL，7.5 碳酸氢 钠2mL，新生 小牛 血清 20mL，用 前混 匀；g)维持液 的配 制（200mL）：Eagles MEM 溶液 190mL，3 谷氨 酰 胺 2mL，1 万 单位 青链霉 素 2mL，7.5 碳酸 氢钠2mL，新 生 小牛血 清 4mL，用前 混匀；h)标本处 理液（100mL）：Eagles MEM 溶液 90mL，50g/mL 庆 大霉素 100 L，1000g/mL 两性霉素 B1mL 和 1

43、000U/mL 青 链霉 素1mL，小牛 血清2mL，用 7.5 碳 酸氢 钠溶液 调 至pH7.2，用 前混匀。B.1.3 标本的 采集 及处 理 具体步 骤如 下：a)患者：无菌 采集 发病 后 5d 内 静脉 血 3mL，放冰 壶 送实验 室分 离血 清，接种 组织细 胞培 养，不能及时 接种 的，将血 清置-20保 存；b)尸体标 本：可取 血、脑脊 液、脑 组织、肝 等；c)蚊：采集 吸过血 的埃 及伊 蚊，白纹 伊蚊或 其 他 可疑 蚊种，用0.50mol/L（10）葡 萄糖 液喂 养，至胃血 完全 消化 后置-20，待死 后按 蚊种 及捕 获地 点分组，以 10 只 20 只 一

44、组为 宜，经 生理 盐 水 冲 洗 数次 后，转入研 磨 器,加 1mL 标 本处 理液，研 碎 均 匀，置 预冷 4 的 离 心 机 上，10000r/min 离心 10min，取上清 液 于 4 作用2h 处 理后接 种 C6/36 细胞。B.1.4 病毒分 离 C6/36（白纹 伊蚊 纯系 细胞 株）传代 细胞 长成 单层 后（在25cm2细 胞瓶、细 胞管、24孔细胞 培养 板等），倒去细胞生 长液换成细胞维持液，如 果传代后立即接种，可用 细胞生长液，在25cm2细胞瓶接种患者 血清20 L，细 胞管和24 孔 细 胞培养 板各接 种3L，蚊 悬液或 组织悬 液根 据浓 度 取接种

45、量，加 样后 适度 混WS 216 2018 11 匀，置35、CO2 培养箱静止培养，观察7d，若细胞出现膨大至融 合，折光度增强、颗粒增 多等现象，取细胞 悬液 用荧 光PCR 检 测 登革病 毒核 酸（不需 提取 病毒RNA），若7d 后 细胞 不 出现病 变，需盲 传1 代2代，仍 不出 现病 变者 经核 酸检测，阴 性者 作阴 性报 告。B.1.5 间接免 疫荧 光试 验（FA/IFA）鉴 定登 革病 毒 B.1.5.1 试验方 法 具体步 骤如 下：a)细胞片 的制 备：把出 现“+”病 变 的 C6/36 细胞 管 倒去维 持液（若 不出 现病 变，则 需培 养 7d再制片），用

46、 pH7.2PBS 洗 2 次 后加 PBS3mL，用 滴 管把细 胞从 管壁 上吹 下，吹散，2000r/min离心5min，弃 去 PBS，加 0.2mL PBS 把 沉渣 吹散，滴加 在 10 孔 的载 玻片 各孔 中，冷 风吹 干，加冷丙 酮固 定 10min，用 PBS 冲洗 2 次，蒸 馏水 漂 洗1 次，冷风 吹干，-20 保 存。正 常 C6/36细胞对 照按 同法 制片；b)试验方 法：取 出保 存的 待 鉴定细 胞片 或脑 组织 片，冷风吹 干，于 各孔 中按 顺 序滴 加 4 个 型登 革病毒使 用单 位的 单克 隆抗 体，各 型 2 孔，对照2 孔 滴加PBS，置 湿盒

47、 内 37 水浴30min，取 出用PBS 冲洗 3 次，蒸 馏水 漂洗1 次，冷风 吹干，滴 加含 130 mol/L（18000）伊 文思 蓝的2单位抗 鼠IgG 荧 光抗 体，置湿盒 内 37 水浴30min，用 PBS 冲洗 3 次，蒸馏 水漂 洗1 次，冷 风吹干，用甘 油缓 冲液 封片，镜检，记 录结 果。B.1.5.2 结果判 断 特异性 免疫 荧光 呈黄 绿色 颗粒，分布 在感 染细 胞的 胞浆内，正 常组 织细 胞被 染成橙 红色 或暗 红。B.1.5.3 意义 从病人 血液、组 织或 蚊媒 中 分离出 登革 病毒，可 确诊 存 在登革 病毒 感染，经 鉴定，可确定 病毒 型

48、别。B.2 应用乳 小白 鼠分 离登 革病 毒 B.2.1 原理 新生小 白鼠 对登 革病 毒十 分敏感，根 据观 察病 毒对 其产生 的致 病等 现象 和应 用特异、敏 感的 检 测 技术，检 出病 毒的 存在 和型 别。B.2.2 仪器和 试剂 参考B.1.2。C6/36 白 纹伊 蚊细胞 改用1日龄 3 日龄 乳小白 鼠。B.2.3 标本采 集及 处理 见B.1.3。B.2.4 病毒分 离 每一标 本接种 一窝1 日龄 3日龄小 白鼠，每只 脑内 接 种全血 或110 血清 或蚊 悬 液、组 织悬液10L20 L，接 种后48h 内 死 亡者作 非特异 性死 亡，弃 去。存 活者观 察至

49、10d左 右 仍未发 病时，剖取 其中2只，取 脑，用pH8.0 肉汤 制 成10 悬液，盲传1 日龄 3日龄小 白鼠 一窝，其余 的 及盲传 的均观 察至 第四周，未发 病作 阴性 结果。在观察 期内 若发 病（松 毛、蜷 缩、活 动力 降低、站 立不稳、抽搐、离群、不 进食、瘫 痪等 症状）则 剖取 半边脑，按 盲传 法制 成10 鼠脑 悬液，转 种1 日龄 3日龄 小白 鼠，并作 无菌 试WS 216 2018 12 验，另 一半脑 置5.43mol/L（50）甘油 缓冲 液中低 温保存。无菌 试验 阴性而 仍出现 以上症 状的 乳鼠 作为可疑 毒株 传代、保 种，并进行 鉴定。B.2.

50、5 病毒鉴 定 具体 步 骤和 方法 如下：a)脑组织 片的 制备：取 发病 濒死的 小鼠 脑组 织以 冰冻 切片制 成 10 孔 组织 片，经 冷风吹 干，冷 丙酮固 定10min，冲洗、吹 干后放-20 保 存。正常 脑 组织同 法制 作。b)试验方 法、结果 和意 义：参考 B.1.5。B.3 RT-PCR 技术 检测 登革 病毒RNA 及型 别鉴 定 B.3.1 原理 PCR 技术（聚 合酶链 反应）是利用 双链DNA 分子 碱基 配 对原则，在一 定条 件下扩 增DNA片 段的 体外 扩增方法。它的 特异 性取决 于两个 人工合 成的 寡核苷 酸引物 的序列，引 物与待 扩增片 段两