1、 学校编码： 10384 分类号 密级 学号： 32720131150555 UDC 硕 士 学 位 论 文 孕激素 受体 （ PR） 靶向 的 18F 标记探针的 设计 、 合成 及 初步生物评价研究 Design, synthesis and preliminary bio-evaluation of progestrone receptor targeting probes for breast cancer imaging with PET 吴晓伟 指导教师姓名： 张现忠 教授 专业名 称： 流行病与卫生统计学 论文提交日期： 2016 年 5 月 论文答辩日期： 2016 年 5 月
2、 学位授予日期： 2016 年 6 月 答辩委员会主席 ： 苏新辉 评 阅 人 ： 2016 年 5 月 厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库目录 目 录 摘 要 . 1 Abstract . 3 缩 略 语 表 . 5 第一章 前言 . 6 1.1 分子影像学 6 1.2 分子成像技术 7 1.3 PET 影像 . 11 1.3.1 PET 影像原理 . 11 1.3.2 PET 影像的应用 13 1.4 乳腺癌 . 14 1.5 孕激素受体 17 1.6 靶向孕激素受体的 PET 成像探针 . 21 本研究的思路、目的和意义 27 第二章 实验材料与仪器
3、 . 29 2.1 主要仪器 29 2.2 主要试剂和耗材 . 29 第三章 孕激素受体靶向的放射性探针 31 3.1 引言 . 31 3.2 孕激素受体靶向的放射性探针的合成探索 31 3.2.1 基于 17-羟孕酮的合成探索 . 31 3.2.2 基于炔孕酮的合成探索 . 39 3.2.3 总结 39 3.3. 孕激素受体靶向的放射性探针的合成 39 3.3.1 标记前体 4(EAET)的合成 . 39 厦门大学博硕士论文摘要库目录 3.3.2 标记前体 9(EAT)的合成 41 3.3.3 标记前体 14 的合成 43 3.4 孕激素受体靶向的放射性探针的放射性标记 . 45 3.4.1
4、 化合物 4(EAET)的放射性标记 45 3.4.2 化 合物 9(EAT)的放射性标记 . 45 3.5 孕激素受体靶向的放射性探针的评价 . 46 3.5.1 18FEAEF 的评价 46 3.5.2 18FEAF 的评价 48 3.6 实验结果 49 3.6.1 18FEAEF 的评价实验结果 . 49 3.6.2 18FEAF 的评价实验结果 54 3.7 讨论总结 56 参 考 文 献 . 58 附 录 . 71 科研成果 . 93 致 谢 . 94 厦门大学博硕士论文摘要库Contents Contents Abstract (in Chinese) 1 Abstract (in
5、 English) 3 Abbreviations 5 Chapter 1 Preface .6 1.1 Molecular imaging .6 1.2 Molecular imaging techniques . 7 1.3 PET imaging .11 1.3.1 PET imaging principle 11 1.3.2 The utilities of PET .13 1.4 Breast cancer 14 1.5 Progestrone receptor .17 1.6 Radioactive probe for targeting progesterone receptor
6、 21 Purpose and meaning of this research 27 Chapter 2 Materials and instruments .29 2.1 Instruments .29 2.2 Materials .29 Chapter 3 Radioactive probe for targeting progesterone receptor 31 3.1 Introduction 31 3.2 Researches in synthesis of progesterone receptor targeted radioactive probe .31 3.2.1 R
7、esearches in synthesis of probes based on 17-hydroxyprogesterone 31 厦门大学博硕士论文摘要库Contents 3.2.2 Researches in synthesis of probes based on ethisterone 39 3.2.3 Conclusion .39 3.3 The synthesis of radioactive probes for targeting progesterone receptor .39 3.3.1 The synthesis of precursor 4(EAET) .39 3
8、.3.2 The synthesis of precursor 9(EAT) 41 3.3.3 The synthesis of precursor 14 43 3.4 18F labelling of probes for targeting progesterone receptor 45 3.4.1 18F labelling of 4(EAET) .45 3.4.2 18F labelling of 9(EAT) 45 3.5 Bio-evaluation of probes for targeting progesterone receptor 46 3.5.1 Bio-evalua
9、tion of 18FEAEF 46 3.5.2 Bio-evaluation of 18FEAF .48 3.6 Experimental results . . .49 3.6.1 Evaluation results of 18FEAEF. .49 3.6.2 Evaluation results of 18FEAF. .54 3.7 Discussion and conclusion .56 References . 58 Appendix .71 Acknowledgements .94厦门大学博硕士论文摘要库摘 要 1 摘 要 乳腺癌是严重威胁女性健康的疾病，它的早期诊断能够有效的
10、降低病人的死亡率。 孕激素受体属于核受体超家族，有 PRA 和 PRB 两种亚型，在调节和控制卵巢，子宫和乳腺的功能方面有重要作用。研究表明，在雌激素受体阳性（ ER+）的乳腺癌病人中， PR 的表达与否不会对病人接受他莫西芬治疗的疗效产生影响。但是在雌激素受体表达阴性（ ER-）的乳腺癌病人中，病人接受他莫西芬治疗的疗效依赖于 PR 的表达。因此，监测 PR 的表达对乳腺癌的早期诊断和 ER-/PR+病人的治疗都是很重要的。 PET 的灵敏度高， 空间分辨率好， 安全性 也 较好， PET探针的核素用量很少，且半衰期短，在体内存在时间短，短时间内能重复使用 。因此，在乳腺癌尚未出现症状表现之
11、前， 利用 PET 成像 直接 非侵袭性的 检测活体状态下 疾病 分子水平的变化，对乳腺癌进行早期的诊断，并进行定性和定量的分析，可有效的防止疾病的进一步发展恶化，减轻病人的痛苦。 在本研究中， 我们基于小分子 炔 孕酮的化学结构 设计了一系列 靶向乳腺癌孕激素受体的 探针 ， 合成得到 EAET 等 3 种前体和稳定的参考化合物， 并 通过 Click反应 成功 获得了 两种 新 型 的 靶向 孕激素受体 的 放射性探 针 18FEAEF 和 18FEAF，并 其 进行理化性质以及 一系列 体内、外的生物学评价 ，考察其作为潜在的肿瘤PET 显像剂的前景。 实验结果表明 ， 18FEAEF
12、放射化学产率 30% - 35%， 放射化学纯度 95%，脂水分配系数 log P = 0.5304 0.06；然后体外稳定性的测定， 在小鼠血清和生理盐水中 37 孵育 30 min， 60 min， 120 min 后的标记率均大于 99%，说明该化合物的体外稳定性较好 ； 18FEAEF 的 小鼠 体内生物 分布实验 表明 ， 其在 经 雌二醇 处理后的卵巢、子宫中的摄取明显高于未处理的对照组 ， 处理组的子宫，卵巢摄取值 5.73 1.83 % ID/g， 4.05 0.73% ID/g，而未处理组子宫，卵巢的摄取值分别为 1.58 0.36 % ID/g， 1.66 0.45% ID
13、/g。 进一步 在 孕激素受体 高表达的MCF-7 和 低表达 的 MDA-MB-231 荷瘤小鼠 中 的显像结果表明 ， 18FEAEF 在MCF-7 中 的摄取较高且能够被抑制 ， 静脉注射给药 2 h 后， 实验组 为 3.15 0.07 % ID/g， 抑制组 为 1.84 0.05 % ID/g，显示出较好的 特异性， 而在 MDA-MB-231厦门大学博硕士论文摘要库摘 要 2 中 的摄取较低 ，肿瘤摄取值为 1.80 0.03 % ID/g， 表明 18FEAEF 可能与 MCF-7 高表达的孕激素受体的结合具有特异性。 18FEAF 放射化学产率 30% - 32%， 放射化学
14、纯度 95%，脂水分配系数 log P = 1.845 0.08；然后体外稳定性的测定， 在小鼠血清和生理盐水中 37 孵育30 min， 60 min， 120 min 后的标记率均大于 99%，说明该化合物的体外稳定性较好 ； 18FEAF 的小鼠 体内生物 分布实验表明 ， 其在经 雌二醇 处理后的卵巢中的摄取明显高于未处理的对照组， 处理组的卵巢摄取值 4.54 2.56% ID/g，而未处理组卵巢的摄取值分别为 2.12 1.78 % ID/g。 放射性探针 18FEAEF， 18FEAF 的合成简单、快速，而且 一步法 标记产率高，条件温和，时间短，而且体外稳定性好， 除此之外 ，
15、 18FEAEF 肿瘤摄取较高， 特异性好 ， 是一个良好的靶向孕激素受体的放射性探针，在乳腺癌的诊断中可能 有良好的应用前景。 关键词： 乳腺癌 ； 孕 激素受体 ； 放 射性探针厦门大学博硕士论文摘要库Abstract 3 Abstract Early diagnosis of breast cancer, which seriously endangers the women all over the world, could effectively promote the curative effect and reduce the mortality rate. Progestero
16、ne receptor (PR) is a member of the nuclear receptor superfamily with two subtypes named PRA and PRB, and plays key roles in mediating and regulating the function of ovary, uterus and mammary gland. Many studies also showed that in ER+ patients, PR expressed or not will not have obvious influence on
17、 the advantages toward the tamoxifen treatment. But in ER-patients, the benefit got from tamoxifen will depend on the status of PR. So, monitoring the PR expression is crucial for not only early diagnosis of breast cancer but curing ER-/PR+ type of breast cancer. PET has high sensitivity, good spati
18、al resolution and security, and nuclide dosage used in probe is very few, half-life is short. Whats more, nuclide discharged from body quickly, can be reused in short time. Therefore, use of PET directly noninvasive detect change of disease in molecular level in living body before disease show sympt
19、oms, early diagnosis of breast cancer, qualitative and quantitative analysis, which can effectively prevent the further deterioration of the disease, relieve the suffering of the patients. In this study, a series of novel radioactive probe targeting PR which highly expressed in the breast cancer wer
20、e synthesized based on the chemical structure of small molecule ethisterone, obtained three kinds of precursors and their reference compound, and got two novel radioactive probe 18FEAEF and 18FEAF targeting PR. Physical and chemical properties of 18FEAEF and 18FEAF were determined and a series of bi
21、ological evaluation in vivo and in vitro were also done to study its potential use as a PET imaging agents. The experimental results showed that the radiochemical yield of 18FEAEF was 30% - 35% (decay-corrected), and its radiochemical purity 95%, log P = 0.5304 0.06; The determination of stability i
22、n vitro was carried out in mice serum and normal saline 厦门大学博硕士论文摘要库Abstract 4 in 37 C after 30 min, 60 min, 120 min incubation, labelling rate were greater than 99%, explained the 18FEAEF had a good stability in vitro; the results of biodistribution indicated its high radioactivity uptakes in uteru
23、s (5.73 1.83 % ID/g at 2 h p.i.) and ovary (4.05 0.73 % ID/g at 2 h p.i.) in the mice treated with estradiol, and the uptakes in uterus and ovary in control group were 1.58 0.36 % ID/g， 1.66 0.45% ID/g respectively. PET imaging in the nude mice bearing MCF-7 (PR+) and 231 tumor (PR-) indicated its h
24、igh uptake in MCF-7 tumor and the value can be inhibited. The radioactivity accumulated in MCF-7 tumor was 3.15 0.07 % ID/g at 2 h p.i When co-injected with 200 g non-radioactivity compound EAEF for blocking， the uptake in MCF-7 tumor was inhibited obviously (1.84 0.05 % ID/g at 2 h p.i.). In PR neg
25、ative MDA-MB-231 tumor bearing mice, the tumor uptake (1.80 0.03 % ID/g at 2 h p.i.) was much lower than that of MCF-7, indicating it might be specifically targeting to PR which overexpressed in MCF-7 tumor. The decay-corrected radiochemical yield of 18FEAF was 30% - 32%, and its radiochemical purit
26、y 95%, log P = 1.845 0.08; The determination of stability in vitro was carried out in mice serum and normal saline in 37 C after 30 min, 60 min, 120 min incubation, labelling rate were greater than 99%, explained the 18FEAF had a good stability in vitro; the results of biodistribution indicated its
27、high radioactivity uptake in ovary (4.54 2.56 % ID/g at 1 h p.i.) in the mice treated with estradiol, and the uptake in ovary in control group was 2.12 1.78 % ID/g. Synthesis of radioactive probe 18FEAEF, 18FEAF is simple, rapid, and production rate is high through one-step radiolabeling process. It
28、 also has milder reaction conditions, shorter reaction time, and good stability in vitro. In addition, 18FEAEF has high tumor uptake and good specificity, indicating may be a good radioactive probe targeting progesterone receptor, and has a good application prospect in the early diagnosis of breast
29、cancer. Keywords: breast cancer; progestrone receptor; radiolabeled probe; 厦门大学博硕士论文摘要库缩 略 语 表 5 缩 略 语 表 PET Positron Emission Tomography 正电子发射计算机断层扫描 CT Computed Tomography 电子计算机断层扫描 MR Magnetic Resonance 磁共振 ER estrogen receptor 雌激素受体 PR progestrone receptor 孕激素受体 DIPEA N,N-Diisopropylethylamine N
30、,N-二异丙基乙胺 AR androgen receptor 雄激素受体 Kryptofix222 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10- 4,7,13,16,21,24-六氧 - diazabicyclo8.8.8-hexacosane 1,10-二氮双环 8.8.8二十六烷 18FFDG 2-deoxy-2-18F-fluoro-D-glucose 2-18F氟 -2-脱氧 -D-葡萄糖 GFP Green fluorescence protein 绿色荧光蛋白 厦门大学博硕士论文摘要库第一章 前 言 6 第 一 章 前言 1.1 分子影像学 分子影像学可以广泛的定义为
31、运用 一些 影像学的手段显示细胞、 组织水平的特定分子 （ 图 1） ，反映活体 的 状态下分子水平的变化， 是 在影像 学 方面 对其生物学的行为 进行定性和定量研究的科学 1。 经典的影像诊断方式（ CT、 MR、超声 ）主要显示的是分子改变带来的终效应，大多是与正常组织表现不同的非特异性的肉眼可见的生理、代谢方面的改变，是 已产生 的 解剖学的改变，不能够检测出疾病的发生、发展和转归 的 过程。而与经典 的 影像诊断方式不同，分子影像是 利用现有的成像技术，将 医学影像 的成像技术与分子生物学相结合 ， 在真实的生理环境中 对人体内部 的 生理或病理过程在分子水平进行无创、实时的成像，直
32、接显示疾病分子水平的异常，从生理、生化水平认识病变组织生物过程的变化、代谢活性的高低、疾病细胞的基因表达状态等，为临床 的 早期诊断、疾病 的治疗 以及 疾病 发生机制 的研究 提供分子水平的信息 2。 分子成像技术包括几个方面 3：具有高度特异性的成像探针，合适的信号放大策略，高灵敏度的检测系统 ， 其中最重要是分子探针，而分子探针通常由能与靶标结合的亲和部分和用于成像的信号部分组成。分子探针必须满足三个条件，第一， 分子 探针 具有良好的生物兼容性，能在生物体内参与正常的生理过程；第二， 分子探针 能够有效的到达靶器官 ，以及细胞内的靶分子 ；第三， 分子探针 具有高的特异性 4。 由于分
33、子探针的浓度只有纳摩尔甚至皮摩尔水平，成像信号很小，需要在体内增大这些信号；特别是对探测灵敏度较低的仪器而言，更要放大信号。由于分子影像技术的信号小，因此需要有高灵敏度的仪器在体外探测信号。 厦门大学博硕士论文摘要库第一章 前 言 7 图 1.分子成像在器官，组织，细胞和基因水平的机制 1.2 分子成像技术 目前的 分子 成像技术主要有核医学成像技术，磁共振技术，光学成像技术，超声技术 （ 图 2） ，各种成像技术的选择是根据特定问题的解决， 具有灵活性 5。核医学技术，又以 PET 的分子成像研究尤为广泛，多用于监视药物在体内的分布，药物代谢动力学，药效学的研究 6-8；磁共振技术因具有优良
34、的软组织对比特性，多用于 软组织病理情况的检测 ，而且能够同时得到解剖结构和生理信息9-12；光学成像技术以生物发光和荧光技术研究为主； CT 成像技术是解剖学成像，多用于骨结构和肺部成像。不同的成像技术主要有五方面的不同：空间分辨率，穿透深度，图像产生的能量消耗，分子探针的相容性，探测器的检测阈值 13（ 表 1） 。 CT 是根据人体不同组织对 X 线的吸收与透过率的不同，应用灵敏度极高的仪器对人体进行测量，然后将测量所获取的数据输入电子计算机，电子计算机对数据进行处理后，就可 得到 人体被检查部位的断面或立体的图像。 CT 扫描往往能得到高分辨率的解剖图像，但是扫描时间长，而且有较高的能
35、量暴露，是观察骨关节及软组织病变的一种理想方式，经常与 PET 和 SPECT 连用，起到很好的互补作用。 核磁共振成像是随着电脑技术、电子电路技术、超导体技术的发展而迅速发厦门大学博硕士论文摘要库第一章 前 言 8 展起来的一种生物磁学核自旋成像技术。它是利用磁场与射频脉冲使人体组织内进动的氢核（ 即 H+）发生章动产生射频信号，经电脑处理而成像的。磁共振成像具有非常好的空间分辨率，并能够同时得到生理和解剖学信息，而且具有良好的软组织对比，其常用来检测软组织的损伤，通常能得到有价值的生理信息 9。目前，磁共振成像已成为研究中风、神经退行性病变等神经中枢系统疾病的首选方法，并提供定性的诊断和定
36、量的形态学信息。除此之外，磁共振成像也用来进行内脏疾病的诊断和分期。但与核医学成像和光学成像技术相比，磁共振成像的敏感度要低几个数量级， 仅达到 pmol 水平， 意味着可能需要更大量的分子探针，这 对生物体的正常代谢可能会 产生影响。 光学成像是利用各种光学分子探针及成像技术，对体内外细胞、生物、组织、生物体进行无创、实时、定位监测分子过程，以实现定性或定量动态研究。主要采用 荧光成像和生物发光两种技术。 前者采用荧光报告基因（ GFP、 RFP、 Cyt及 dyes 等）进行标记，其中以 GFP 应用最多，其表达产物为绿色荧光蛋白，可在体外激发光的激发下发出荧光，被 CCD 相机捕获。后者
37、是用荧光素酶基因标记细胞或 DNA，基因表达产物能够与体外导入的荧光素反应而发出荧光，从而被 CCD 相机捕获。 光学成像 操作简单、结果直观、测量 快速 、灵敏度高及费用低 廉的优点， 多适合监测生物表面的结构 或是成像 细微 结构，还能够利用具有不同波普特性的不同探针，进行多通道成像，类似于体外的核型分析。由于光学成像技术的穿透力有限，只有几毫米到几厘米，目前只用在小动物模型的研究；而且不同探针的波长范围有限 ，还有光吸收和散射的 现象 ，光学成像技术不能分辨活体内任何深度的细胞活动 。 超声成像是利用超声 声束扫描人体，通过对反射信号的接收、处理，以获得体内器官的图像 。超声成像主要是用
38、来解剖结构和生理学的成像，以及进行实时的干预。常用来判断脏器的位置、大小、形态，确定病灶的范围和物理性质，提供一些腺体组织的解剖图，鉴别胎儿的正常与异常，在眼科、妇产科及心血管系统、消化系统、泌尿系统的应用十分广泛。超声成像由于花费低，安全方便，是在临床中应用最广泛的成像方式。但是，由于超声的物理性质，使超声对骨骼、肺和胃肠的检查受到限制。声像图表现所反映的是器官和组织声阻抗的改变，缺少特异性，因 此 对于病变的性质的判断，需综合分析，并与其他影像学表现和临厦门大学博硕士论文摘要库第一章 前 言 9 床资料相结合才可靠。 核医学成像所检 测的信号是 进入 生物体内的放射性核素 发 出的射线，图
39、像信号所 反映 的是 放射性核素 在体内的 浓度分布 情况 ，显示 机体的 形态学信息和功能状态，是一种功能性的成像，以正常组 织与病变之间的放射性药物的浓度差别为基础的脏器或病变的显像方法 ，是目前最成熟的分子影像技术 。核医学成像 具有灵敏度高、可定量以及由动物实验 可以 直接推及临床等优点。 核医学成像主要包括单光子发射计算机断层成像 （ SPECT） 和正电子发射断层成像 (PET)。两者均有较高的灵敏度，而且可以 进行 定量 或半定量 ，进行无创伤的检测。核医学成像具有多种动态成像的方式，能提供多种功能参数以反映机体及组织的血流功能、受体 和 代谢 方面 等信息。 图 2. 各种成像
40、技术及应用实例 。 (A)小鼠注射 18FFDG 后， micro-PET 的全身冠状面成像 ,显示的是示踪剂在肌肉、心脏、大脑等组织的 摄取 和由于肾的清除在膀胱的积累。 (B)小鼠腹部静脉注射碘化对比剂后的 CT 成像的冠状面。 (C)小鼠注射 99mTc 标记的亚甲基二磷酸盐后 , micro-SPECT 对其进行的腹部和骨盆区域成像的冠状面，由于示踪剂的集聚显示了脊柱、骨盆、尾椎、股骨和膝关节的图像。 (D)光学反射荧光成像，显示小鼠肝脏 ,腹部、脊椎和大脑中的绿色荧光蛋白，小鼠体内有表达绿色荧光 蛋白的肿瘤细胞，扩散至全身不同位点。 (E)MR 对小鼠厦门大学博硕士论文摘要库Degr
41、ee papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. Fulltexts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on http:/ and submit requests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-CALIS member libraries, please mail to for delivery details. 厦门大学博硕士论文摘要库
