1、1人 波形蛋白 (VIM)酶联免疫 分析 (ELISA)试剂 盒使用说 明书本试 剂仅供研 究使用 目的 ：本试剂 盒用于测 定人血清 ，血浆及 相关液体样本中 波形蛋白 (VIM)的含量。实验 原理 ：本 试剂 盒 应用 双 抗体 夹 心法 测 定 标 本 中 人 波 形蛋 白 (VIM)水 平。 用 纯化 的 人 波 形蛋 白(VIM)抗体 包被 微孔板 ， 制成 固相 抗 体 ， 往包 被 单抗 的微 孔中加入 波形 蛋白 (VIM)， 再与 HRP标 记的 波 形蛋 白 (VIM)抗 体结 合， 形成 抗体 -抗 原 -酶 标抗 体复 合物 ， 经过 彻底 洗涤 后 加 底 物TMB显
2、色 。 TMB在 HRP酶的 催化 下转化 成蓝色 ，并 在酸的 作用下 转化 成最终 的黄色 。颜色 的深 浅和 样品 中的 波 形蛋 白 (VIM)呈 正相 关。 用酶 标仪 在 450nm 波 长下 测定 吸光 度（ OD值 ） ， 通过 标准曲线 计算 样品 中 人 波形 蛋白 (VIM)的浓 度。试剂 盒组成 ：试剂 盒组成 48孔配 置 96孔配 置 保存说明 书 1份 1份封板 膜 2片（ 48） 2片（ 96）密封 袋 1个 1个酶标 包被板 1 48 1 96 2-8 保存标准 品： 900ng/m l 0.5ml 1瓶 0.5ml 1瓶 2-8 保存标准 品稀释液 1.5m
3、l 1瓶 1.5ml 1瓶 2-8 保存酶标 试剂 3m l 1瓶 6m l 1瓶 2-8 保存样品 稀释液 3m l 1瓶 6m l 1瓶 2-8 保存显色 剂 A液 3m l 1瓶 6m l 1瓶 2-8 保存显色 剂 B液 3m l 1瓶 6m l 1瓶 2-8 保存终止 液 3ml 1瓶 6ml 1瓶 2-8 保存浓缩 洗涤液 （ 20ml 20倍） 1瓶 （ 20ml 30倍） 1瓶 2-8 保存样本 处理及要 求 ：1.血清 ： 室温 血液自然 凝固 10-20分钟 ， 离心 20分钟 左右 （ 2000-3000转 /分 ） 。 仔细 收集上清， 保存过程 中如出现 沉淀，应 再
4、次离心 。2.血 浆： 应根 据标 本的 要求 选择 EDTA或 柠檬 酸钠 作为 抗凝 剂， 混合 10-20分 钟后 ，离 心20分 钟左 右（ 2000-3000转 /分 ） 。 仔细 收集 上清 ，保 存过 程中 如有 沉淀 形成 ，应 该再 次离心 。3.尿 液： 用无 菌管 收集 ，离 心 20分 钟左 右（ 2000-3000转 /分 ） 。 仔细 收集 上清 ，保 存过 程中如 有沉淀形 成，应再 次离心。 胸腹水、 脑脊液参 照实行。4.细胞 培养上清 ： 检测 分泌性的 成份时 ， 用无 菌管收集 。 离心 20分钟 左右 （ 2000-3000转 /分 ） 。 仔细 收集
5、 上清 。检 测细 胞内 的成 份时 ，用 PBS（ PH7.2-7.4） 稀释 细胞 悬液 ，细 胞浓度 达到 100万 /m l 左右 。 通过 反复冻融 ， 以使 细胞破坏 并放出细 胞内成份 。 离心 20分2钟左 右（ 2000-3000转 /分 ） 。仔 细收集上 清。保存 过程中如 有沉淀形 成，应再 次离心。5.组织 标本 ： 切割 标本后 ， 称取 重量 。 加入 一定量的 PBS， PH7.4。 用液 氮迅速冷 冻保存备用 。标 本融 化后 仍然 保持 2-8 的 温度 。加 入一 定量 的 PBS（ PH7.4） ， 用手 工或 匀浆 器将标 本匀 浆充分 。离心 20分
6、钟 左右 （ 2000-3000转 /分 ） 。仔 细收 集上清 。分装 后一 份待检测 ，其余冷 冻备用。6.标本 采集 后尽早 进行提 取， 提取按 相关文 献进 行，提 取后应 尽快 进行实 验。若 不能 马上进行 试验，可 将标 本放于 -20 保存 ，但 应 避免 反复冻融 .7.不能 检测含 NaN3的样 品 ，因 NaN3抑制 辣根过氧 化物酶的 （ HRP）活 性。操作 步骤： 1. 标准 品的稀释 与加样： 在酶标包 被板上设 标准品孔 10孔， 在第一、 第二孔中 分别加标准品 100l， 然后 在第一 、 第二 孔中加标 准品稀释 液 50l， 混匀 ； 然后 从第一孔
7、、 第二孔中 各取 100l 分别 加到第三 孔和第四 孔 ， 再在 第三 、 第四 孔分别加 标准品稀 释液 50l，混匀 ； 然后 在第三孔 和第四孔 中先各取 50l 弃掉 ， 再各 取 50l 分别 加到第五 、 第六 孔中 ， 再在 第五 、 第六 孔中分别 加标准品 稀释液 50ul， 混匀 ； 混匀 后从第五 、 第六 孔中各取 50l 分别 加到 第七、 第八孔 中， 再在第 七、第 八孔 中分别 加标准 品稀 释液 50l，混匀后 从第 七、第 八孔中 分别 取 50l 加到 第九 、第十 孔中， 再在 第九第 十孔分 别加 标准品稀 释液 50l，混 匀后从第 九第十孔 中
8、各取 50l 弃掉 。 （稀 释后各孔 加样量都 为 50l，浓度 分别为 600ng/m l ， 400ng/m l ， 200ng/m l ， 100ng/m l ， 50ng/m l ） 。2. 加样 ：分别设 空白孔（ 空白对照 孔不加样 品及酶标 试剂，其 余各步操 作相同 ） 、 待测 样品孔 。 在酶 标包被板 上待测样 品孔中先 加样品稀 释液 40l， 然后 再加待测 样品 10l（ 样品最 终稀释度 为 5倍 ） 。 加样 将样品加 于酶标板 孔底部， 尽量不触 及孔壁， 轻轻 晃动 混匀 。3. 温育 ：用封板 膜封板后 置 37 温育 30分钟 。4. 配液 ： 将 3
9、0（ 48T的 20倍 ） 倍浓 缩洗涤液 用蒸馏水 30（ 48T的 20倍 ） 倍稀 释后备用 。5. 洗涤 ：小心揭 掉封板膜 ，弃去液 体， 甩干 ，每 孔加满洗 涤液，静 置 30秒后 弃去，如 此重复 5次， 拍干。6. 加酶 ：每孔加 入酶标试 剂 50l，空 白孔除外 。7. 温育 ：操作同 3。8. 洗涤 ：操作同 5。9. 显色 ：每孔先 加入显色 剂 A50l，再 加入显色 剂 B50l，轻 轻震荡混 匀， 37 避光 显 色15分钟 .10.终止 ：每孔加 终止 液 50l，终 止反应 （此 时蓝色立 转黄色 ） 。11.测定 ： 以空 白空调零 ， 450nm 波长
10、依序测量 各孔的 吸光 度 （ OD值 ） 。 测定 应在加终 止液后 15分钟 以内进行 。注意 事项： 1 试剂 盒从冷藏 环境中取 出应在室 温平衡 15-30分钟 后方可使 用，酶标 包被板开 封后如未用完 ，板条应 装入密封 袋中保存 。2 浓洗 涤液 可能 会有 结晶 析出 ，稀释时 可在水浴 中加温助 溶 ，洗 涤时不影 响结果。3 各步 加样均应 使用加样 器 ， 并经 常校对其 准确性 ， 以避 免试验误 差 。 一次 加样时间 最好控制 在 5分钟 内，如标 本数量多 ，推荐使 用排枪加 样。4 请每 次测定的 同时做标 准曲线 ， 最好 做复孔 。 如标 本中待测 物质含
11、量 过高 （ 样本 OD值大于 标准品孔 第一孔的 OD值 ） ，请 先用样品 稀释液稀 释一定倍 数（ n倍） 后再测定 ， 计3算时 请最后 乘以 总稀 释倍数（ n 5） 。5 封板 膜只限一 次性使用 ，以避免 交叉污染 。6 底物 请避光保 存。7 严格 按照说明 书的操作 进行，试 验结果判 定必须以 酶标仪读 数为准 .8 所有 样品，洗 涤液和各 种废弃物 都应按传 染物处理 。9 本试 剂不同批 号组分不 得混用。10.如与 英文说明 书有异， 以英文说 明书为准 。计算 ： 以标 准物的浓 度为横坐 标， OD值为 纵坐标，在坐 标纸上绘 出标准曲 线，根据 样品的 OD值
12、由 标准曲线 查出相应 的浓度； 再乘以 稀释倍数 ；或 用标准物 的浓度与 OD值计 算出标准曲 线的直线 回归方程 式，将样 品的 OD值代入 方程式， 计算出样 品浓度， 再乘以 稀释倍数 ，即 为样品的 实际浓度 。（此 图仅供参 考）试剂 盒性能： 1.样品 线性回归 与预期浓 度相关系 数 R值为 0.92以上 。2.批内 与批见应 分别小于 9%和 15%检测 范围： 20ng/m l -800ng/m l保存 条件及有 效期： 1.试剂 盒保存 ： ； 2-8 。2有 效期： 6个月4FORRESEARCHUSEONLYHuman vimentinDrugNamesGeneri
13、cName：Human vi menti ni ii ii i (VI MI I I ) ELI SAI I I Ki ti i i . . . .PurposeThiskit allowsf or t hedet erminat ion of VI Mconcent rat ions inHumanserum, bloodplasma,andot her biological f luids.PrincipleoftheassayThekit assayHumanVI Mlevel int hesample， usePurif iedHumanVI Mt ocoat microt it er
14、plat e wells, makesolid-phaseant ibody, t hen addVI Mt o wells, CombinedVI Mant ibody whichWit h HRPlabeled, become ant ibody - ant igen - enzyme-ant ibody complex, af t er washingComplet ely, Add TMB subst rat e solut ion, TMB subst rat e becomes blue color At HRPenzyme-cat alyzed, react ion ist er
15、minat ed byt he addit ion of asulphuricacidsolut ion andt hecolor change is measured spect rophot omet rically at a wavelengt h of 450 nm. Theconcent rat ion of VI Mint he samplesist hendet ermined bycomparingt heO. D. of t he samplest ot hest andardcurve.Materialsprovidedwiththekit5Mat erials provi
16、dedwit ht hekit 48det erminat ions 96det erminat ions St orageUsermanual 1 1Closureplat emembrane 2 2Sealedbags 1 1Microelisast ripplat e 1 1 2-8St andard： 900ng/m l 0. 5ml 1bot t le 0. 5ml 1bot t le 2-8St andarddiluent 1. 5ml 1bot t le 1. 5ml 1bot t le 2-8HRP-Conjugat ereagent 3ml1bot t le 6ml1bot
17、t le 2-8Samplediluent 3ml1bot t le 6ml1bot t le 2-8ChromogenSolut ionA 3ml1bot t le 6ml1bot t le 2-8ChromogenSolut ionB 3ml1bot t le 6ml1bot t le 2-8St opSolut ion 3ml1bot t le 6ml1bot t le 2-8wash solut ion （ 20ml 20f old） 1bot t le （ 20ml 30f old） 1bot t le 2-8Specimenrequirements1. serum- coagula
18、t ionat roomt emperat ure 10-20mins， cent rif ugat ion 20-minat t hespeedof2000-3000r. p. m. removesupernat ant , I f precipit at ion appeared, Cent rif ugal again.2. pl asmal l l -use suit ed EDTA or cit rat e plasma as an ant icoagulant , mix 10-20mins , cent rif ugat ion 20-min at t he speedof 20
19、00-3000 r. p. m. remove supernat ant , I fprecipit at ion appeared, Cent rif ugal again.3. Uri nei i i -collect sueast erilecont ainer, cent rif ugat ion 20-minat t hespeedof 2000-3000r. p. m.remove supernat ant , I f precipit at ion appeared, Cent rif ugal again. The Operat ion ofHydrot horaxandcer
20、ebrospinal f luidRef erencet oit .4. cel l l l l l l l cul turel l l supernatant-det ect secret ory component s, collect sueast erile cont ainer,cent rif ugat ion 20-minat t he speedof 2000-3000r. p. m. removesupernat ant , det ect t hecomposit ion of cells, Dilut cell suspensionwit h PBS（ PH7. 2-7.
21、 4 ） , Cell concent rat ionreached 1 million / ml, repeat ed f reeze-t haw cycles, damage cells and release ofint racellular component s, cent rif ugat ion 20-minat t he speedof 2000-3000r. p. m. removesupernat ant , I f precipit at ion appeared, Cent rif ugal again.5. Ti ssuei i i sampl esl l l -Af
22、 t er cut t ing samples, checkt heweight , add PBS（ PH7. 2-7. 4） , Rapidlyf rozenwit h liquidnit rogen, maint ain samplesat 2-8 af t er melt ing, add PBS（ PH7. 4） ,Homogenizedbyhandor Grinders, cent rif ugat ion 20-minat t he speedof 2000-3000r. p. m.6removesupernat ant .6. ext ract as soon as possi
23、ble af t er Specimen collect ion, and according t o t he relevantlit erat ure, andshouldbeexperiment assoonaspossibleaf t er t he ext ract ion. I f it cant ,specimencanbekept in-20t opreserve, Avoidrepeat edf reeze-t hawcycles.7. Cant det ect t hesamplewhichcont ainNaN3, becauseNaN3inhibit s HRPact
24、ive.Assayprocedure1. Dilut e andaddsamplet o St andard: set 10St andard wellsont he ELI SAplat es coat ed, addSt andard100l t ot hef irst andt hesecondwell, t henaddSt andarddilut ion50l t ot hef irst andt hesecondwell, mix; t ake out 100l f ormt he f irst andt he secondwell t hen addit t o t het hi
25、rdandt he f ort h well separat ely. t hen addSt andard dilut ion 50l t o t he t hird andt he f ort hwell , mix ; t hent akeout 50l f romt het hird andt hef ort h well discard, add50l t ot hef if t h andt hesixt h well , t hen addSt andarddilut ion 50l t ot hef if t h andt hesixt h well, mix; t akeou
26、t 50lf romt hef if t h andt hesixt h well andaddt ot hesevent handt heeight hwell, t henaddSt andarddilut ion 50l t o t he sevent h andt he eight h well , mix ; t ake out 50l f romt he sevent h andt heeight hwell andaddt ot henint handt het ent h well, addSt andarddilut ion 50l t ot henint handt het
27、 ent h well, mix, t akeout 50l f romt henint handt het ent h well discard(addSample50l t oeachwell af t er Dilut ing, (densit y: 600ng/m l ， 400ng/m l ， 200ng/m l ， 100ng/m l ， 50ng/m l )2. addsample： Set blankwellsseparat ely (blankcomparisonwellsdont addsampleandHRP-Conjugat ereagent , ot her each
28、st epoperat ionissame). t est ing samplewell. addSampledilut ion 40l t o t est ing samplewell, t hen addt est ing sample10l (samplef inal dilut ionis5-f old), addsamplet owells, dont t oucht hewell wall asf ar aspossible, andGent ly mix.3. I ncubat e: Af t er closingplat ewit hClosureplat emembrane,
29、 incubat e f or 30minat 37 .4. Conf igurat e liquid: 30-f old (or 20-f old)washsolut ion dilut ed 30-f old (or 20-f old) wit h dist illedwat er andreserve.5. washing： Uncover Closureplat emembrane, discardLiquid, drybyswing, addwashingbuf f ert oeverywell, st ill f or 30st hendrain, repeat 5t imes,
30、drybypat .6. addenzyme： AddHRP-Conjugat ereagent 50l t oeachwell, except blankwell.7. incubat e： Operat ionwit h3.8. washing： Operat ionwit h5.79. color：AddChromogenSolut ionA50ul andChromogenSolut ion Bt o eachwell, evadet helight preservat ionf or 15minat 3710. St op t he react ion：AddSt op Solut
31、ion50l t o eachwell, St op t he react ion(t he bluecolorchanget oyellowcolor).11. assay：t akeblankwell aszero, Readabsorbanceat 450nmaf t er AddingSt opSolut ionandwit hin15min.Importantnotes1. Thekit t akes out f romt he ref rigerat ion environment shouldbebalanced15-30minut es int heroomt emperat
32、ure, ELI SAplat es coat edif hasnot useupaf t er opened, t heplat eshouldbest oredinSealedbag.2. washingbuf f er will Cryst allizat ion separat ion, it canbeheat ed t he wat er helpsdissolvewhendilut e. Washingdoesnot af f ect t heresult .3. addSamplewit h sampler Eachst ep, Andproof read it s accur
33、acyf requent ly, avoidst heexperiment al error. add sample wit hin 5 mins, if t he number of sample is much ,recommendt ouseVolley.4. if t het est ing mat erial cont ent isexcessivelyhigher (ThesampleODisbigger t han t hef irstst andard well ), please dilut e Sample(n-f old), Pleasediluent eandmult
34、iplied byt he dilut ionf act or .（n5）.5. Closureplat emembraneonlylimit s t hedisposableuse, t oavoidcross-cont aminat ion.6. Thesubst rat e evadet helight preservat ion. . . .7. Pleaseaccordingt o useinst ruct ion st rict ly, Thet est result det erminat ion must t ake t hemicrot it er plat ereader
35、asast andard.8. All samples, washingbuf f er andeachkindof reject shouldaccordingt o inf ect ive mat erialprocess.9. Donot mixreagent s wit ht hosef romot her lot s.CalculateTaket he st andard densit y ast he horizont al , t he ODvaluef or t he vert ical , drawt he st andard curveongraphpaper, Findo
36、ut t he correspondingdensit y accordingt o t hesampleODvaluebyt he Samplecurve, mult iplied byt hedilut ion mult iple, or calculat e t he st raight line regressionequat ionof t hest andard curvewit ht hest andarddensit y andt he ODvalue, wit h t he sampleODvalueint he equat ion,calculat e t hesampledensit y, mult iplied byt hedilut ion f act or ,t heresult ist hesampleact ual densit y.8Assayrange20ng/m l -800ng/m lStorageandvalidity1St orage：2-8.2validit y：sixmont hs.Thi si i i chart forreferenceonl yl l l
