1、学校编码： 10384 分类号 密级 学 号： 21720081152539 UDC 硕 士 学 位 论 文 一株源于海洋环境的新鞘氨醇菌降解高分子量 PAHs 的分子机制研究 Study on HMW-PAH metabolic mechanism in Novosphingobium pentaromativorans US6-1 isolated from marine environment 吕意华 指导教师姓名： 田蕴 副教授 专 业 名 称： 微生物学 论文提交日期：2011年 7 月 论文答辩时间：2011年 8 月 学位授予日期：2011年 月 答辩委员会主席： 评 阅 人：
2、2011 年 07 月 带格式的: 居中, 缩进: 首行缩进:0 字符厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库2厦门大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文 中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的工作成果。 对本文的研究工作作出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 : 日 期 : 年 月 日 带格式的厦门大学博硕士论文摘要库3厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦
3、门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版， 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅， 有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1.保密（），在年解密后适用本授权书。 2.不保密（ ） （请在以上相应括号内打 “”） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 厦门大学博硕士论文摘要库目录 1目 录 摘 要 . 1 Abstract . 2 第一章 前言 4 1 海洋环境中多环芳烃的来源与危害 4 1.1 海洋环境中多环芳烃的来源
4、与分布 .4 1.2 高分子量多环芳烃 .6 1.3 多环芳烃的危害 .7 2 多环芳烃污染环境的生物修复 9 2.1 降解 PAHs 的微生物 9 2.2 海洋微生物是去除 PAHs 污染的主力军 . 11 2.3 高分子量 PAHs 污染的修复 11 3 多环芳烃降解途径的研究方法 14 3.1 基因组学研究方法 . 14 3.2 转录组学研究方法 . 17 3.3 蛋白组学研究方法 . 18 3.4 代谢组学研究方法 . 22 4 本论文的研究内容及意义 24 第二章 材料与方法 . 26 1 材料 . 26 1.1 降解菌株 . 26 1.2 主要试剂 . 26 1.3 主要仪器 .
5、27 1.4 主要分析软件 . 28 1.5 主要培养基 . 28 1.6 溶液配制 . 28 厦门大学博硕士论文摘要库目录 22 基本方法 30 2.1 PAHs 降解率测定 30 2.2 电子传递系统活性（ ETSA）测定 31 2.3 SDS-PAGE 电泳分析 31 2.4 双向电泳（ 2D-E）分析 . 32 2.5 关键酶基因的表达 . 35 第三章 结果与分析 . 39 1 新鞘氨醇单胞菌 US6-1 对 PAHs 的降解特性 . 39 1.1 新鞘氨醇菌 US6-1 对菲的降解 . 39 1.2 新鞘氨醇菌 US6-1 对芘的降解 . 41 1.3 新鞘氨醇菌 US6-1 对苯
6、并芘的降解 . 42 2 双向电泳条件优化 44 2.1 蛋白变性剂成分 . 45 2.2 蛋白还原剂浓度 . 46 2.3 蛋白上样量 . 48 2.4 等点聚焦电压 . 49 3 US6-1 在不同 PAHs 诱导下的蛋白表达 . 52 3.1 单向和双向电泳蛋白提取 . 52 3.2 差异蛋白条带分析 . 54 4 双向电泳追踪 US6-1 降解 PAHs 过程中的差异表达蛋白 . 57 4.1 蛋白样品定量 . 57 4.2 PDQuest 软件分析 . 57 4.3 差异蛋白的质谱鉴定 . 64 5 降解关键酶基因的表达动力学 74 5.1 引物特异性分析 . 74 5.2 基因表达
7、荧光定量 PCR 分析 78 第四章 讨论 . 81 1 新鞘氨醇单胞菌 US6-1 对 PAHs 的降解特性 81 厦门大学博硕士论文摘要库目录 32 蛋白提取及电泳条件分析 81 3 PAHs 降解的功能蛋白分析 . 82 4 PAHs 关键功能降解基因表达分析 . 84 第五章 结论与展望 . 86 1 结论 . 86 2 本论文创新点 86 2.1 新内容 86 2.2 新技术 87 3 展望 . 87 参考文献 88 附录 98 附录一 参与的科研课题、发表和待发表的学术论文 . 98 科研课题： 98 发表和待发表的学术论文： 98 附录二 目标基因序列 98 1. PAH rin
8、g-hydroxylating dioxygenase alpha subunit (5-3) . 98 2. 4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase (5-3) 99 3. 16S rRNA (5-3) . 100 致 谢 102 厦门大学博硕士论文摘要库Contents 摘要 1Contents Abstract(in Chinese) . 1 Abstract(in English) . 2 Chapter 1 Introduction . 4 1 The source of PAHs in marine environment and its harmful
9、ness .4 1.1 The source of PAHs in marine environment .4 1.2 High Molecular Weight (HMW) PAHs 6 1.3 PAHs harmfulness .7 2 Bioremediation of PAHs contaminated environment .9 2.1 PAH-degrading microorganism 9 2.2 PAH-degrading microcrganism in marine environment . 11 2.3 Biodegradation of HMW PAHs 11 3
10、 The study methods of PAH biodegradative pathway . 14 3.1 Genetics research 14 3.2 Transcriptomic research 17 3.3 Proteomics research 18 3.4 Metabolomics research . 22 4 Objectives and significance of this study . 24 Chapter 2 Materials and Methods . 26 1 Materials . 26 1.1 PAH-degrading strain . 26
11、 1.2 Reagents . 26 1.3 Equipments . 27 1.4 Main software . 28 1.5 Media . 28 1.6 Reagents preparation 28 厦门大学博硕士论文摘要库Contents 摘要 22 Methods. 29 2.1 Analysis of PAHs biodegradation . 30 2.2 Measurement of ETS activity . 31 2.3 SDS-PAGE analysis . 31 2.4 Proteomics research 32 2.5 Kinetic analysis of
12、key enzyme expression 35 Chapter 3 Results and Analysis 39 1 The PAHs degradative characteristics of Novosphingobium pentaromativorans US6-1 . 39 1.1 Biodegradation of phenanthrene . 39 1.2 Biodegradation of pyrene . 41 1.3 Biodegradation of benzoapyrene 42 2 Optimization of two-dimensional electrop
13、horesis(2D-E) 44 2.1 Composition of denaturant . 45 2.2 Concentration of reductant . 46 2.3 Load sample . 48 2.4 Voltage of isoelectric focusing electrophoresis . 49 3 Analysis of protein profile induced by PAHs . 52 3.1 Protein extraction for SDS-PAGE and 2D-E 52 3.2 Identification of differential
14、proteins 54 4 Analysis of protein expression induced by PAHs 57 4.1 Protein quantitation 57 4.2 PDQuest analysis 57 4.3 Identification of differential proteins 64 5 Kinetic analysis of key enzyme expression . 74 5.1 Analysis of primerspecificity . 74 5.2 Real-time reverse transcription (RT)-PCR . 78
15、 Chapter 4 Discussion 81 厦门大学博硕士论文摘要库Contents 摘要 31 PAHs degradative characteristics of US6-1 . 81 2 Optimazation of protein extraction and 2D-E 81 3 Identification of functional proteins induced by PAHs 82 4 Kinetic analysis of key enzyme expression . 84 Chapter 5 Conclusion and Perspective 86 1 Co
16、nclusions . 86 2 Statement of novelty 86 2.1 New object . 86 2.2 Novel research technique 87 3 Perspectives . 87 References 88 Appendix 98 Appendix 1 Projects and Publications 98 Projects . 98 Publications 98 Appendix 2 Sequence of target gene 98 1. PAH ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit (
17、5-3) . 98 2. 4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase (5-3) 99 3. 16S rRNA (5-3) . 100 Acknowlegements 102 带格式的: 正文, 制表位: 不在 34.57 字符厦门大学博硕士论文摘要库Contents 摘要 1厦门大学博硕士论文摘要库摘 要 摘要 1摘 要 多环芳烃是一类在环境中有广泛分布的有机化学污染物，具有“三致” （致畸、致突变、致癌） ，通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。微生物的降解与转化是消除 PAHs 污染的有效方式。研究降解菌的遗传控制、探索代谢途径、解析相关酶系和功能基
18、因，从而构建基因工程菌株用于污染环境的生物修复是当前的研究热点。 本论文对一株从 Ulsan 海湾（韩国）沉积物中筛选到的高效 PAHs 降解菌Novosphingobium pentaromativorans US6-1 对菲、芘和苯并芘（三环至五环 PAH）降解特性、差异表达蛋白质组、关键酶基因表达等方面进行了较为系统的研究，获得的主要结果如下： 1. GC-MS 结果显示， 新鞘氨醇菌 US6-1 能高效降解 3-5 环 PAHs， 经过 24h，36h 和 48h 后对起始浓度为 10ppm 的菲、芘和苯并芘的降解率分别可达到86.62%， 31.81% 和 22.18%； 2. 在双
19、向电泳（ 2D-E）分离差异表达蛋白前对 N. pentaromativorans US6-1全蛋白提取和电泳过程中的主要影响因子进行了优化，结果表明：以变性剂为7M 尿素 /2M 硫脲，还原剂 DTT 为 20mM，上样量为 150g，最大聚焦电压为8, 000V 时能获得理想的蛋白图谱； 3. 通过功能蛋白组学分析和串联质谱鉴定，发现了在 PAHs 诱导下 N. pentaromativorans US6-1 产生了的包含 PAHs 降解，转运和调节因子，碳代谢，氨基酸代谢， 核苷酸代谢， 特殊功能蛋白和未知功能蛋白在内的七大类功能蛋白； 4. 根据环羟基化双加氧酶 亚基和 4-羟基苯甲酸
20、 3-单加氧酶的基因序列信息设计特异性引物，采用反转录实时 PCR 分析发现这两个基因的表达在不同底物诱导下均有不同程度的上调； 5. N. pentaromativorans US6-1 在通过环羟基化双加氧酶开环后经一系列的酶作用后，经 3-氧代乙二酸通路中的水杨酸或者邻苯二甲酸支路生成 TCA 循环的中间代谢物进入 TCA 循环并最终降解成 H2O 和 CO2。 关键词： 高分子量多环芳烃，生物降解，蛋白质组学，基因表达，代谢机制 厦门大学博硕士论文摘要库Abstract 2Abstract Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are one
21、class of organic pollutants, widely distributed in the environment. They are carcinogenic, teratogenic, and mutagenic to living organisms by food chain. It is an efficient way to recover PAHs contamination by microbial remediation. It is a hotspot field to construct Genetic Engineering Microorganism
22、s (GEMs) capable of bioremediating contaminated environment, which denpends on the elucidation of genes and corresponding enzymes involved in PAHs degradation and therefore the clarification of genetic regulation and metabolism pathways. In order to gain insight into the mechanism of High Molecular
23、Weight PAHs(HMW-PAHs), Novosphingobium pentaromativorans US6-1, a marine bacterium isolated from muddy sediment of Ulsan Bay, Republic of Korea, was used to study the PAHs degradative characteristics, identification of the functional enzymes and genes involved in the biodegradation base on a proteom
24、e analysis of N. pentaromativorans US6-1 exposed to phenanthrene, pyrene and benzoapyrene, and elucidating PAHs biodegradative pathway. The main results were as follows: 1. N. pentaromativorans US6-1 could degrade PAHs effectively, with the increasing of ETS activity value, the residual rate of 10pp
25、m phenanthrene, pyrene and benzoapyrene decreased by 88.09%, 33.11% and 23.58% respectively; 2. After the optimization of major factors in two-dimensional electrophoresis for N. pentaromativorans US6-1, the optimal conditions of 2D-E for N. pentaromativorans US6-1 were using 7M urea/2M thiourea as d
26、enaturant, 20mM dithiothreitol as reductant, 150g loading sample and peak voltage at 8,000V; 3. To identify proteins involved in the degradation, a proteome analysis of cells exposed to phenanthrene, pyrene and benzoapyrene was conducted and several protein groups were found, including PAHs degradat
27、ion， transporter and regulation factor, crbon metabolism， amino acid metabolism， nucleotide metabolism， individual functional protein and hypothetical/unknow protein; 4. Real-Time PCR was used to compare the ring-hydroxylating dioxygenase 厦门大学博硕士论文摘要库Abstract 3alpha subunit (RHD) and 4-hydroxybenzoa
28、te 3-monooxygenase gene expression induced by phenanthrene, pyrene and benzoapyrene. The results indicated that the gene of these two enzymes were variously unregulated after exposure to PAHs; 5. N. pentaromativorans US6-1degrades PAHs via multiple metabolic routes initiated by ring-hydroxylating di
29、oxygenase, further degradation via either o-phthalate pathway or salicylate pathway; both pathways are subsequently entered tricarboxylic acid (TCA) cycle and mineralized to CO2 and H2O. Keywords High-molecular-weight PAHs; Biodegradation; Proteomics; Gene expression; Biodegradative mechanism 厦门大学博硕
30、士论文摘要库前言 4第一章 前言 1 海洋环境中多环芳烃的来源与危害 1.1 海洋环境中多环芳烃的来源与分布 多环芳烃（ PAHs）是一类由两个或两个以上的苯环以线形排列、弯接或簇聚的方式而构成的有机物。随着苯环数量的增加，其脂溶性越强而水溶性越低 , 致癌，致畸，致突变效应也随之增强。作为最早发现且数量最多的致癌物，目前已发现的致癌性 PAHs 及其衍生物已超过 400 种1。海洋环境中 PAHs 的来源主要有三种途径：生物代谢合成、地球化学作用合成以及人类活动的输入。前两者属于天然的 PAHs 来源，包括微生物和高等植物合成以及火山活动、海底漏斗、森林大火和沉积物矿化等过程。 人类活动的输
31、入是海洋环境中 PAHs 的主要来源，包括石油污染、油轮泄漏、煤及石油等天然燃料的不完全燃烧等。它们以城市生活污水工业废弃物、大气沉降和地面径流的途径进入海洋环境。据报道，每年有数十万吨石油产品和原油从炼油厂和石化厂的废弃物中排放到世界范围的海洋环境中，燃料燃烧过程产生的 PAHs（尤其在北半球工业化地区） ，经大气传输可产生世界范围 PAHs 的迁移作用2。 Connel 等3的研究表明，由燃烧产生的 PAHs经空气传输是天然环境中 PAHs 的最主要来源，世界海洋中约 10%18%的 PAHs来源于大气沉降。 由于陆地及大气的一切“废污”的最终归属地都是海洋，而 PAHs 具有迁移的特性，
32、并在迁移过程中稳定存在，因此海洋尤其是近海成为污染的“收容所” 。不同海域 PAHs 的质量浓度差别较大，海水中 PAHs 的最高质量浓度为34,338.0ng/L， 最低为 13.0ng/L， 海洋沉积物中 PAHs 的最高质量比为 1,670.0g/g,最低为 24.1 ng/g。近海工业的发展程度及都市化进程与海域环境中 PAHs 的浓度存在明显的正相关关系。贝类的 PAHs 浓度比其他生物体高4。 海洋环境中常见的 PAHs 有菲 (phenanthrene)、芘 (pyrene)、荧蒽 (fluoranthene) 和苯并 a芘（ benzoapyrene） 。由于 PAHs 的低水
33、溶性及高的辛醇 -水分配系数，它们在水中的浓度非常低。然而，由于它们的疏水特性，易在沉积物尤其是有机碳颗粒中富集5。根据 Witt（ 1995）6研究表明在波罗地海，与表层水相比表层沉积物中的 PAHs 含量要高出 105-106，海水中以 2-3 环的 PAHs（萘、苊烯、菲）厦门大学博硕士论文摘要库前言 5占主导，而在其沉积物中则以苯并 a芘等 5-6 环的 PAHs 占主导。 PAHs 在沉积物中的含量范围从几个 g/kg 到 g/kg，高浓度的 PAHs 通常出现在重工业和高人口密度地区的河口港湾的沉积物中，可高达 500g/kg9.8g/kg7。沉积物中高浓度 PAHs 主要来源于大
34、气沉降，海上石油泄漏，近岸工业废水，生活污水的排放以及轮船运输过程中石油烃的不完全燃烧等等8。 1979 年，美国环保局 ( EPA) 首先公布 129 种优先监测污染物，其中 PAHs有 16 种 （图 1.1） 。 而后欧洲将 6 种 PAHs ( F1、 B b F1、 B k F1、 B a Py、 B ghi Pe、 1 ,2 ,32cd Py)作为目标污染物，我国国家环保局也将 7 种 PAHs列入中国环境优先污染物黑名单9, 10。曹学丽等11调查表明，江河湖海特别是各国近海及海湾区域沉积物富集了大量的多环芳烃。一般常见的 PAHs 包括菲、荧蒽、芘、萘、苯并 a芘等均在我国海岸
35、地区检出。在珠江河口区12、长江河口区13、渤海海峡地区14、厦门西海域15，大亚湾海域16芘、苯并 a芘、苯并 b荧蒽等强致癌性的高分子量 PAHs 都有不同程度的检出。 厦门大学博硕士论文摘要库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. Fulltexts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on http:/ and submitrequests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-CALIS member libraries, please mail to for delivery details.厦门大学博硕士论文摘要库
