1、Click-iT EU成像检测试剂盒 Page 1 kFluor488 Click-iT EU 成像检测试剂盒 说明书修订日期： 20160907 产品编号： KGAU331-100/KGAU331-500/KGAU331-1000 Store at -20 , protected from light For Research Use Only 一、组份及保存温度 组份 KGAU331-100 KGAU331-500 KGAU331-1000 保存温度 稳定性 组份 A： EU 0.2ml 1ml 2ml -20 按指定稳定保存可有效放置一年 组份 B： kFluor488-azide 30
2、l 530l 1030l -20，避光 组份 C： 10 Click-iT EU反应缓冲液 1ml 5ml 10ml 2-8 组份 D： CuSO4 0.5ml 2.5ml 5ml 2-8 组份 E： Click-iT EU 缓冲液添加物 30mg 530mg 1030mg 2-8 组份 F： Hoechst 33342 25l 125l 250l 2-8 其他所需试剂 10mM PBS,pH7.2-7.6 中性多聚甲醛固定液（ 4%多聚甲醛 in PBS） 2mg/ml甘氨酸溶液（去离子水配制 ） 促渗试剂（ 0.5% Triton X-100 in PBS） 3% BSA in PBS，
3、pH7.2-7.6 去离子水 18 18-mm 盖玻片 规格 :针对 96孔板培养的细胞， KGAU331-100可以提供 至少 100个孔反应的量； KGAU331-500可以提供 500个孔反应的量， KGAU331-1000是可以提供 1000个孔反应的大包装。 （不同容器细胞成像的具体用量可参考附表 1.EU培养基及染色反应液的使用量参考） 荧光光谱数据 : kFluor488-azide: 495/520nm; Hoechst 33342: 350/461nm, bound to DNA. Click-iT EU成像检测试剂盒 Page 2 二、产品介绍 细胞增殖检测是评估细胞健康程
4、度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。最精确的检测细胞增殖方法是BrdU法。 EU法检测试剂盒是 brdu方法的革命性突破。 EU（ 5-溴 -2-脱氧尿嘧啶）试剂盒是一种嘧啶类似物，可以在 DNA合成期整合入 DNA双链。 EU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。 本试剂盒中， EU试剂含有炔烃，而 kFluor488染料试剂含有叠氮化合物。点击法的 EU标记增殖快速有效，易于使用。只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的 EU。标准化的戊二醛固定和去污剂促渗可以使检测试剂进入细胞，而 brdu方法则需要 DNA变性（如酸变性、热变性或者用 D
5、nase消化）去暴露 BrdU，从而方便 BrdU抗体结合。 本试剂盒包含 EU法检测所需要的所有组份，可以检测细胞增殖与细胞周期分析。对于细胞周期的分析，试剂盒可以提供蓝色细胞核染料 Hoechst33342。 培养细胞 可选：样本处理 EU孵育细胞 细胞固定与促渗 检测 EU 可选：抗体孵育或其他细胞染色固定 拍照及分析 EU成像检测工作流程 Click-iT EU成像检测试剂盒 Page 3 三、实验操作步骤 1、 EU标记细胞 注意： EU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐客户以 10M的 EU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能
6、影响细胞的标记效果。预实验中，我们建议客户设置一系列的 EU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。您也可以参考本操作说明 附表 2.常见细胞系 EU孵育时间设定参考 以及 附表 3.细胞实验 EU孵育浓度及时间参考 。 1.1 以每孔 41031105细胞接种于 96孔板中，进行您所需要的药物处理或者其 他刺激处理。 1.2 准备一份 2的 EU工作液 (组份 A)：以完全培养基稀释 10mM的储液至合适的工作浓度。建议您以 10M的初始工作浓度开始预实验。 1.3 预热 2的 EU工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为 1（如：需要得到 10M的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到 2
7、0M的 EU工作液中。 ） 1.4 合适时间合适条件孵育细胞， EU孵育细胞的时间可以直接用做测定细胞 DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的 EU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。 2、 细 胞固定及促渗 注意： 本参考步骤是针对以 4%中性多聚甲醛 固定且以 0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作 方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等等。 2.1 孵育完成后，去除培养基加入 50l 4%中性多聚甲醛至各个孔的玻片上，室温孵育 15-30分钟后，去除固定液。 2.2
8、每孔加入 50l 2mg/ml的甘氨酸溶液，室温孵育 5分钟，中和残留的固定液。 2.3 以每孔 0.1ml 3% BSA in PBS 的洗涤液 洗涤细胞 2次。 2.4 去除洗 涤液，加入 0.1ml 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育 20分钟。 3、 EU检测 注意： 本参考步骤每个孔反应使用 100L的 Click-iT反应混合物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。 3.1 准备 1 Click-iT EU反应缓冲液（组份 C） :转移 10组份 C试剂以去离子水稀释 10倍即可。 3.2 制备一份 5的 Click-iT EU
9、反应添加物储液（组份 E）：加 0.3mL去离子水至含 30mg的 E组份试管中，混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在 -20，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意： 不同规格的组份 E均按照此比例加去离子水溶解为 5储液备用 ）。 3.3 准备 1Click-iT EU缓冲液添加物（见表格 2）：以去离子水稀释 5储液至 1，溶液应新鲜配制，当天用完。 Click-iT EU成像检测试剂盒 Page 4 3.4 依据表 2准备 Click-iT反应混合物。表 2要求添加的组份对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。 表 2. Click-iT 反应混合物： 3
10、.5 去除促渗液，以每孔 0.1mL的 3%BSA in PBS的洗涤液洗涤 2次，去除洗涤液。 3.6 加入 0.1mL Click-iT反应混合物至每个孔，简短摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖细胞。 3.7 室温避光孵育 30min。 3.8 除去反应混合物，每孔以 0.1mL 3%BSA in PBS洗涤 2次，去除洗涤液。 对于核染色，可以进行 DNA复染。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。 4、 DNA复染 4.1 以 0.1mL PBS洗涤每孔 1次，去掉洗涤液。 4.2 以 PBS稀释 Hoechst33342（组份 F）储液 1： 2000至 1Hoechst33342
11、溶液，终浓度为 5 g/mL。 4.3 每孔加 0.1mL 1Hoechst33342溶液，室温避光孵育 15-30min。除去 Hoechst33342溶液。 4.4 0.1mL PBS洗涤每孔 2次，去除洗涤液。 5、 成像及分析 Table 3. 荧光发射光谱 . Fluorophore Excitation (nm) Emission (nm) kFluor488 495 520 Hoechst 33342, bound to DNA 350 461 附录： 表 1 EU培养基及染色反应液的使用量参考 96 孔板 * 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5 cm 小皿 EU培养基
12、 100 l 150 l 200 l 500 l 1ml 2 mL 染色反应液 100 l 150 l 200 l 500 l 1ml 2 mL 反应组份 以 10个孔的样本数为例 1Click-iT反应缓冲液 （组份 C） 860l CuSO4 (组份 D) 40l kFluor488-azide (组份 B) 3l 1反应缓冲液添加物 (步骤 3.3所准备 ) 100l 总体积 1ml Click-iT EU成像检测试剂盒 Page 5 表 2 常见细胞系 EU孵育时间设定参考 3T3 Hela HEK293* 细胞系 人胚胎细胞 酵母细胞 人成纤维细胞 人宫颈癌细胞 人胚肾细胞系 人神经
13、细胞 细胞周期 30min 3h 18h 21h 25h 5d 孵育时间 5min 20min 2h 2h 2h 1d 表 3 细胞实验 EU孵育浓度及时间参考 PubMed ID Reference Cell line Concentration Time 18272492 Salic A, et al. PNAS. 2008 NIH3T3, Hela 10 nM10 M 1 hr 18521918 Cappella P,et al. Cytometry A. 2008 HL-60, A2780, U2OS 110 M 30 min 18996411 Chehrehasa F, et al.
14、 J Neurosci Methods. 2009 Neurospheres 120 M 24 hr 19179371 Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009 Primary fibroblasts 10 M 1,2,4 hr 19253396 Warren M, et al. Dev Dyn. 2009 Chick embryos 10 M2 mM 4 hr 19647746 Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009 Spleen cells 50 M 24 hr 19544417 Momcilovi
15、O, et al. Stem Cells. 2009 Human ES cells 10 M 30 min 20080700 Cinquin O, et al. PNAS. 2010 emb-30 1 M 12 hr 20025889 Han W, et al. Life Sci. 2009 VSMC 50 M 2 hr 20659708 Huang C, et al. J Genet Genomics. 2010 ESC 50 M 2 hr 21310713 Hua H, et al. Nucleic Acids Res. 2011 fission yeast strains 10 M 3
16、hr 20824490 Lv L, et al. Mol Cell Biochem. 2011 EJ cells 50 M 4hr 21248284 Yang S, et al. Biol Reprod. 2011 GC cells 50 M 2 hr 21227924 Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res. 2011 U2OS, HT29 30 M 90 min 21829621 Guo T, et al. PloS One. 2011 HIT-T15 50 M 4hr 21980430 Zeng T, et al. PloS One. 2011 MCF-10
17、A 25 M 2hr 22012572 Ding D, et al. Int Orthop. 2011 C3H10T1/2 10 M 24hr 22000787 Zeng W, et al. Biomaterials. 2011 EPC 50 M 4hr 21913215 Xue Z, et al. J Cell Biochem. 2011 SGC7901 25 M 24hr 22016038 Peng F, et al. Lasers Med Sci. 2011 MSC 50 M 2hr 21878637 Li D, et al. J Biol Chem. 2011 HCC 50 M 2hr
