1、 PRODUCT INFORMATION AND MANUAL Mouse IFN- precoated ELISPOT kit Cat# : DKW22-2000-096(strips) For research use only. Not for diagnostic or therapeutic procedures （ 1301） 达优系列产品 Mouse IFN- DKW22-2000 (strips) 目录 产品简介： . 2 技术原理： . 3 试剂盒提供的试剂、规格： . 4 试剂的配制： . 5 检测操作： . 6 操作相关指导 . 8 试剂盒的保存： . 9 常见问题及解决
2、方案： . 10 参考文献： 11 预包被 ELISPOT 试剂盒系列产品 . 12 ELISPOT 试剂盒相关产品 13 ELISPOT 试剂盒辅助试剂 14 实验记录一： . 15 实验记录二： . 17 -2- 产品简介： 酶联免疫斑点（ ELISPOT）技术是当今世界上检测生物体细胞免疫水平的最佳技术。 它集高灵敏度、 高可信度、高通量、单细胞水平、功能性检测与低成本等诸多优点于一身，在国内外免疫学界获得了广泛的应用，成为主流免疫学检测技术之一。 达科为公司生产的达优系列 ELISPOT 预包被试剂盒采用原装进口高亲和力高效价抗体对，经预包被 PVDF板、低温冷冻干燥、真空密封包装等工
3、艺流程制备。成品PVDF 板上预包被的抗体分布均匀、效价稳定， 2 8可存放 12 个月。 达优系列预包被 ELISPOT 试剂盒使实验检测时间从 3 天缩短为 2 天，大幅度减少无菌操作的实验步骤，减轻实验者的劳动强度和减少污染的机会。 使得实验者能够轻松、高效地完成复杂的 ELISPOT 检测实验。 国内首创了可拆卸板条的应用， 在保留预包被技术优良品质的基础上，使 ELISPOT 实验更加方便、节省，适用性更高。-3- 技术原理 A.用抗 -干扰素的单克隆抗体包被在检测孔的底部。 B.分离待检测样本的淋巴细胞。 C.将待测细胞放入检测孔中培养约 20 小时，同时加入特异抗原。在培养期间，
4、对特异抗原有反应的 T 淋巴细胞就会被激活，开始分泌特定的细胞因子（如 -干扰素） ，这些细胞因子同时被板底的单克隆抗体捕获 ；对特异抗原没有反应的细胞则不受刺激，也不分泌特定的细胞因子（如 -干扰素） 。 D.移出细胞，板底留下细胞因子的潜在影像。 E.这种潜在的影像可以通过酶联显色的方式变成真正的影像 斑点。 F.每一个斑点代表了一个对特异抗原有反应的特异性 T淋巴细胞。斑点的数目多少就反映 了样本的细胞免疫的识别状态：斑点多说明免疫识别状态好 ，斑点少说明免疫识别状态差或者出现免疫耐受。-4- 试剂盒提供的试剂、规格 名 称 规格（ 96T） Biotinylate antibody 5
5、0L2 Streptavidin-HRP 50L2 Dilution buffer R（ 1） 10mL2 Washing buffer (50) 10mL AEC dilution 10mL AEC solution（ 20） 500L AEC solution（ 20） 500L AEC solution （ 200） 50L 阳性刺激剂 50T 预包被 PVDF【板条可拆卸】 1块 需要实验者自行准备的试剂与仪器 1. RPMI-1640 基本培养基（需要添加双抗，不需添加血清） 2. 无血清培养基（完全培养基，即用型） 3. 超净工作台 4. CO2细胞培养箱 5. 微量移液器及配套
6、Tip 6. 8 通道微量移液器 7. 0.5mL, 1.5mL EP 管 8. Biosys Bioreader 自动读板仪-5- 试剂的配制 1 Washing buffer (50): 用去离子水稀释 (1:50)，制成 1 Washing buffer 备用。 2 生物素标记的抗体 （ Biotinylated antibody， Secondary antibody）：用 Dilution buffer R（ 1） 稀释 (1:100)，即为工作液。 3 酶联亲和素 （ Streptavidin-HRP）： Dilution buffer R（ 1）稀释 (1:100)，即为工作液。
7、 4 AEC 显色液： 在洁净的容器内将 AEC dilution、 AEC solution（20 ） 、 AEC solution （20 ） 、 AEC solution （200 ） 按照 180:10:10:1 的比例混匀，即为工作液。可参见下表。 AEC 显色液工作液室温下的半衰期约 30 分钟，使用时现用现配。 总体积 AEC dilution AEC Solution（20 ） AEC Solution （20 ） AEC Solution （200 ） 3mL 2.7mL 150L 150L 15L 5mL 4.5mL 250L 250L 25L 8mL 7.2mL 400L
8、 400L 40L 10mL 9mL 500L 500L 50L 5 无血清培养基： 推荐使用 ELISPOT 无血清培养基。如果没有，可用含 5-10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基代替。 6 阳性刺激剂按标签重悬即为工作液。-6- 检测操作 第一天：接种细胞，加入刺激物，培养 （严格注意无菌操作） 1. 预包被板的活化 ：每孔加入 200L 无血清培养基或者RPMI-1640 培养基，室温静置 5-10 分钟后将其扣出。 2. 加入细胞悬液 ：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100L/well。 正对照孔：细胞浓度可采用 1105 cells/well； 负对照孔：细胞浓度可采
9、用 1105 cells/well； 背景负对照：加入重悬细胞用培养基（无血清培养基或含胎牛血清的 RPMI-1640 培养基）； 实验孔：样品细胞浓度由实验者根据实验自行调整。 3. 加入刺激物 ： 10L/well，具体如下： 正对照孔：加入阳性刺激剂工作液。 负对照孔【含背景负对照孔】：加入无血清培养基（或重悬细胞用培养基）； 实验孔：加入实验者自己的刺激物（用无血清培养基或者 RPMI 1640 配制成 10终浓度）。 4. 孵育： 所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入 37，5 CO2培养箱培养 16-20 小时。-7- 第二天：培养后操作 （不再需要无菌操作） 1. 裂解细胞 ：
10、倾倒孔内细胞及培养基。加冰冷的 去离子水 ，200L/well， 4冰箱放置 10 分钟低渗裂解细胞。 2. 洗板 ：倾倒孔内液体， 1Washing buffer， 200L/well，洗涤 5-7次。每次停留 30-60 秒。最后一次，在吸水纸上扣干。 3. 检测抗体孵育 ：将稀释好的 生物素标记的抗体 工作液加入各实验孔， 100L/well。 37 孵育 1 小时。 4. 洗板 ：倾倒孔内液体， 1Washing buffer， 200L/well，洗涤 5 次。每次停留 30-60 秒。最后一次，在吸水纸上扣干。 5. 酶联亲和素孵育 ：将稀释好的 酶标亲和素 工作液加入各实验孔，1
11、00L/well。 37孵育 1 小时。 6. 洗板 ：倾倒孔内液体， 1Washing buffer， 200L/well，洗涤 5 次。每次停留 30-60 秒。最后一次，在吸水纸上扣干。 7. 显色 ：将现配的 AEC 显色液 工作液加入各实验孔， 100L/well。室温避光静置 15-45 分钟（在 20 -25，显色 25 分钟较合适）。若室温低于 20，建议在 37孵箱做显色，每隔 5-10 分钟检查一次。 8. 终止显色 ：倾倒孔内液体，揭开板底座，用 去离子水 /自来水 洗涤正反面及底座 3-5 遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。 9. ELISPO
12、T 板斑点计数 ，并记录斑点的各种参数，做统计分析。 -8- 操作相关指导 关于洗涤： 用排枪每孔加入 200-300L 洗涤缓冲液，多了易溢出。加入洗涤缓冲液之后浸泡 30-60 秒。然后扣出洗涤液。注意：所有从孔中移出液体的步骤均需用力甩出或者扣出，勿用枪头去吸，以免碰刮、损伤到膜。洗涤步骤的最后一次操作需要在吸水纸上拍干。吸水纸最好采用进口棉纸，强度高，不掉屑，吸水量大，使用前需要高压灭菌。不充分的洗涤将加重膜背景，对斑点计数造成干扰。 显色前请启开底座挡板，清除底座积液，防止膜背景加重。 注意事项： 1. Washing buffer (50x) 4存放后出现结晶析出为正常现象，用前半
13、小时置于 37轻摇混匀可消除结晶，对实验结果无影响。 2. Dilution buffer R(1x) / Dilution buffer R(10x) 有少量沉淀为蛋白正常饱和析出，用前静置沉降，取用上清即可，不影响实验结果。 3. 实验前请务必将板条编号，预防实 验过程中因板条掉落而造成的混淆，推荐两端编号，防 止板条断裂；扣干过程同样需采取相应措施，防止板条松动掉落； 4. 取下板条时，请开启后盖，从后均匀按压板条两端，使其掉落。从正面取用板条易致其不规则断裂； -9- 试剂盒的保存 4C 保存可稳定 12 个月。 开启后建议一次性用完。 必要时分装保存。注意事项： 1. 预包被板条请在
14、超净台中开启包装，取用后剩余板条请放回真空铝箔袋中，置入透明自封袋密封保存，推荐使用无菌封口膜将板条逐根封口，也可视每次取用量分装保存； 2. 板架为重复利用，再次使用前可选择酒精或者紫外消毒等方式。 -10- 常见问题及解决方案： 现象 原因分析 改进措施 膜着色较重，背景较深 1 洗板不彻底； 2 PVDF 膜没有干透，底座内残留液体 1 提高洗板次数，保证每次浸泡30 秒； 2 PVDF 膜干透后再读板。 斑点形状不规则，成团严重 1 细胞破碎 2 细胞成团 1 优化淋巴细胞分离液，坚持细胞活性计数，确保细胞活性； 2 细胞悬液充分混匀，确保呈单细胞状态； 阳性对照斑点着色淡，较模糊，
15、1 酶活力下降 2 显色试剂温度低，出现氧化现象 3 刺激物效价低 1 提高酶浓度； 2 显色试剂使用前平衡到室温，勿使用已出现氧化沉淀的试剂；3 提高刺激物浓度 阳性对照出现此现象时判为细胞状态参差不齐，存活率低 1 优化淋巴细胞分离液，坚持细胞活性计数，确保细胞活性； 2 加强细胞洗涤，去除死细胞；斑点大小不一，颜色深浅差异大 阳性对照正常时判为刺激物特异性程度低 1 更换刺激物 阳性对照正常时判断为刺激物特异性问题，正常细胞应答水平低 1 改变刺激浓度； 2 提高试验孔的细胞总数； 斑点较少 阳性对照斑点少时判断为加入的存活细胞数太少 1 增加细胞的总量； 2 进行活性计数， 提高细胞活
16、性；斑点太多，影响计数 细胞数过大 1 稀释细胞，确定最佳浓度 -11- 参考文献 1. 刘光泽 ,等 .J中国免疫学杂志 ,2005,21(5):367-368 2. 孙 雯 ,等 .J中华器官移植杂志 ,2005,26(5):265-268 3. 张宜俊 ,等 .J检验医学 ,2006,21(1):8-11 4. 周明奎 ,等 .J中国免疫学杂志 ,2007,12 5. 肖伟玲 ,等 .J细胞与分子免疫学杂志 ,2007,23(12):1130-1132,1135 6. 许丽锋 ,等 .J中国生物制品学杂志 ,2007,20(12):907-909 7. 董富敏 ,等 .J现代食品与药品杂
17、志 ,2007,17(4):3-5 8. 刘光泽 ,等 .J中国病理生理杂志 ,2007,23(1):99-102 9. 袁有成 ,等 .J中国药学杂志 ,2007,42卷 (13):998-1002 10. 张春涛 ,等 .J中华微生物学和免疫学杂志 ,2007;27(11):1059-1060 11. Xian-Hua Wang, et,al.JWorld J Gastroenterol， 2005； 11(36)： 5614-5620 12. Xu-Dong Tang, et,al.JCancer Research,2008,68(5):15291537 13. 忻亚娟 等 . 冻干甲型
18、肝炎减毒活疫苗诱导的人体特异性免疫应答 J. 中国疫苗和免疫 . 2009,14(3): 246-249 14. 赵小霞 等 . 大肠杆菌麦芽糖结合蛋白 (MBP) 诱导小鼠 Th1 细胞的活化作用 J. 中国免疫学杂志 . 2009,25(6): 504-507 15. 张晓光 等 . 含 H5N1-HA 基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导免疫应答的初步探讨 J. 中华实验和临床病毒学杂志 . 2009,23(2): 97-99 16. 南文龙 等 . 人 -禽双价流感新型 DNA 疫苗构建及免疫保护实验研究 J. 中国科学 C辑 :生命科学 . 2009,39(6): 534-541 17.
19、 李 丽 等 . 荷 S-180 移植瘤小鼠血清干扰素 含量的变化及免疫调节药物的干预作用 J. 南方医科大学学报 . 2008,28(1): 65-68-12- 预包被 ELISPOT 试剂盒系列产品 货 号 名 称 规 格DKW22-1000-048 48 T DKW22-1000-096 96 DKW22-1000-500 Human IFN- precoated ELISPOT kit 596TDKW22-1000-096(strips) 96 T DKW22-1000-500(strips) Human IFN- precoated ELISPOT kit （板条可拆卸） 596TD
20、KW22-1020-048 48 DKW22-1020-096 96 T DKW22-1020-500 Human IL-2 precoated ELISPOT kit 596TDKW22-1040-048 48 DKW22-1040-096 96 T DKW22-1040-500 Human IL-4 precoated ELISPOT kit 596TDKW22-2000-048 48 DKW22-2000-096 96 T DKW22-2000-500 Mouse IFN- precoated ELISPOT kit 596TDKW22-2040-048 48 DKW22-2040-09
21、6 96 T DKW22-2040-500 Mouse IL-4 precoated ELISPOT kit 596TDKWHBV-1001-048 48T DKWHBV-1001-096 HBV C IFN- ELISPOT kit 96T DKWTB-1002-048 48T DKWTB-1002-096 TB IFN- ELISPOT kit 96T DKWHBV-1001-096(strips) HBV C IFN- ELISPOT kit （板条可拆卸） 96T DKWTB-1002-096(strips) TB IFN- ELISPOT kit （板条可拆卸） 96T -13- E
22、LISPOT 试剂盒相关产品 1. 淋巴细胞分离液 货 号 名 称 规 格 DKW-LST-015 24 支 /盒 DKW-LST-050 Human Lymphocyte Separation Tube 人淋巴细胞分离管 10 支 /盒 DKW-LSH-0100 100mL DKW-LSH-0400 Human Lymphocyte Separation Medium 人淋巴细胞分离液 4100mLDKW33-R0100 100mL DKW33-R0400 Mouse 1 Lymphocyte Separation Medium 小鼠淋巴细胞分离液 4100mL2. 达优冻存试剂盒 货 号
23、名 称 规 格 UH-M1002-050 达优Freezing kit（达优冻存试剂盒） 50mL 3. ELISPOT 无血清培养基 货 号 名 称 规 格 DKW34-EU0100 100mL DKW34-EU0400 Serum-Free Medium for ELISPOT, universal（广谱型） 4100mLDKW34-EH0100 100mDKW34-EH0400 Serum-Free Medium for ELISPOT, human（人类） 4100mL-14- ELISPOT 试剂盒辅助试剂 货 号 名 称 规 格DKW-F010-1 全套人 ELISPOT 辅助试剂盒 1096 TDKW-F010-2 全套小鼠 ELISPOT 辅助试剂盒 1096 TDKW-STD-001 酶联免疫斑点法 ELISPOT标准品试剂盒 50T DKW-STD-F F 肽 10T DKW-ST-PI PMA / Ionomycine 50T DKW-ST-P PHA 50T DKW01-0010 PVDF coating buffer 596 T DKW02-0001 96 T DKW02-0010 AEC coloring system 1096 T-15- 实验记录一 -16- -17- 实验记录二 -18-
