1、 R5421 Chemically Competent Cell 产品说明书 产品规格（CAT#：YC1080） R5421 Competent Cell 100l /支 保存： -80（3个月） pGADT7 (control vector, 10ng/l) 10l 保存：-80（12个月） Carrier DNA (5g/l) 100l 保存：-20（12个月） PEG/LiAC 5ml 保存： 4（12个月） 基因型 MAT ura3-52 leu2 trk1 his3200 his4-15 trk21:pCK64 产品说明 R5421酿酒酵母菌株为K+/钾离子缺陷型菌株，在文献中也称为
2、CY162，MAT型，多用于K+/钾离子转运蛋白的鉴定试验中，也可用于K+/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定试验。Transformation marker为：ura3，leu2，该菌株可以在含有100mM KCl的培养基中国正常生长，在含有5-10mM KCl的培养基中生长缓慢，当培养基中KCl浓度低于0.5mM，R5421（CY162）细胞停止生长。R5421感受态细胞经特殊工艺制作，-80可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率104 cfu/g DNA。 操作方法 1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态，步骤如下：Carrier DNA 放95水浴或金
3、属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min，再次放95水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min以上。 2. 取100 l冰上融化的R5421感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-3 g，Carrier DNA10 l，PEG/LiAc 500 l并吸打几次混匀，30水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。 3. 将管放42水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。 4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 l 重悬，离心 30s弃上清。 5. ddH2O 50 l重悬，涂板，29培养48-96 h。 培养基配制 YPDA (1
4、L): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。 0.2% adenine (1L) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22m 滤膜过滤除菌。 注意事项 1. 感受态细胞最好在冰上融化。 2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。 4. R5421酵母菌株对高温敏感，
5、最适生长温度为27-30；高于31，生长速度和转化效率呈指数下降。 5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。 6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29，80-90h培养可见直径1 mm克隆。 SD medium (1L): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121，15 min高压灭菌。
