1、第二章 单细胞藻类培养,Company Logo,第二章 单细胞藻类培养,一、单细胞藻类的种类与生物特性 （一）单细胞藻类培养的种类 常用的饵料微藻主要有： 牟氏角毛藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体； 三角褐指藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体、种贝； 中肋骨条藻：虾、蟹幼体； 底栖舟形藻：鲍、海参、海胆、埋栖贝类、舔食螺类的附着幼体； 底栖卵形藻：同上； 等鞭金藻：贝、虾、蟹、海参、海胆的幼体； 亚心形四片藻：轮虫、卤虫、种贝及虾的后期幼体； 海水小球藻：同上； 钝顶螺旋藻：虾、蟹幼体及配合饲料的添加剂；,Company Logo,（二）单细胞藻类的生物学,1、盐度： 大多数单胞藻盐度适应范围很宽。
2、10-40大多数单胞藻能适应。 如扁藻、盐藻、小球藻在10-80的盐度中能正常生长。,Company Logo,2、温度,适温 绿色巴夫藻10-35； 扁藻7-30 ； 盐藻4-40 。 因此大多数单细胞藻类适合在20-25 下培养。 一些单胞藻适合在较高温度下生存；如钝顶螺旋藻生存最适为28-34 。,Company Logo,低温,单胞藻一般忍耐性较强，在一定的低温条件下产生的形态和生理变化是可逆的。 利用其在低温环境下呈休眠状态的特点，可较长时间保存单细胞藻类。 如在-20 温度下，冰冻20d的三角褐指藻浓缩藻液，解冻后，培养2d即可恢复正常生长。,Company Logo,3、光照,5
3、000-10000lx，适合大多数单细胞藻类的培养。 某些藻类适合在弱光下培养： 如中肋骨条藻：5000lx较适宜，而10000lx产生抑制作用）； 三角褐指藻：3000-5000lx 某些单细胞藻适合较强的光照： 等鞭藻：7000-9000lx 角毛藻:10000-15000lx 某些单细胞藻类适合在强光下培养： 如钝顶螺旋藻：30000-35000lx。,Company Logo,4、pH,7.5-8.5是大多数藻类的适宜范围。 也有一些藻类适合碱性条件： 如钝顶螺旋藻8.6-9.5。,Company Logo,5、繁殖,主要以二分裂繁殖为主。 可将培养过程分为：延缓期、对数（指数）生长期
4、、相对生长下降期、静止期和衰亡期。,Company Logo,二、藻种的分离,（一）采样 个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。 但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料微藻，一般个体很小，往往在几微米到十几微米，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回实验室处理。 水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻种的数量较多时，可立即进行分离，若数量少，必须先经过预备培养，待数量增多后再分离。,Company Logo,（二）预备培养,1、容器： 通常采用三角烧瓶。 2、培养液： 各种藻类的培养液存在差异。 土壤抽出液:取土壤1kg，加纯水1000ml，煮沸60min，在暗
5、处放置2d，过滤，以滤液600ml加纯水400ml。 土壤抽出液：取土壤1kg，加纯水1000ml，再加入NaOH2-3g，煮沸120min，冷却后过滤，滤液直接使用。 土壤抽出液：取土壤1kg，加纯水2000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧瓶中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上清液，再煮沸煎浓。第三天在如法煎浓，最后倾入三角烧瓶中，加棉花塞，煎浓，直至得到1000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸灭菌保存。,Company Logo,土壤抽出液：取田园土壤1kg，加水2000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清，煮沸消毒后使用。 海泥（或土壤）抽出液：用海滩上砂质较少，有机物较多而又不是过
6、分淤黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置1-2min，待粗砂，小石沉下，把上层泥浆倾入铝锅内，弃去底部粗砂，小石等杂物。静置24h，吸取上清液使用。,Company Logo,3、管理,搅动或摇动： 浮游种类应每天摇动一次。 附着种类应静置不动。 经常观察，掌握时机及时分离： 如发现藻类呈淡淡颜色，即进行显微镜检查，如需分离藻类已占优势，应立即进行分离。 如没有需要分离的藻类，便重新进行采样及预培养。,Company Logo,（三）分离方法：,1、微吸管分离法： 选直径约5mm的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。
7、 微吸管的另一端套接一条长约30cm或8cm的医用乳胶管。 在分离操作时长乳胶管的另一端用牙齿咬紧，如用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。 将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察挑取要分离的藻类细胞，吸取时把微吸管对准藻细胞，然后牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入，接着吸入的水滴放入另一凹玻片上，观察是否是目标单胞藻。 然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞棉塞，在适宜光照下培养。每天摇动一次。,Company Logo,2、水滴分离法,将微吸管插入水样中约2cm深，提取微吸管，待无水滴自然滴下，把微吸管与载玻片接触，即有一小水滴水样留在载玻片上。
8、按照上述方法，吸取水滴3-4滴，水滴作直线排列，相互间隔一段距离。然后在显微镜下观察每个水滴，如果某一水滴中藻细胞只有一个需要分离的藻细胞，即用培养把水滴连同藻类细胞冲入试管中，并加入培养液到试管容量的1/4，试管口塞上棉花塞，放在适宜光照下培养，每天摇动一次。,Company Logo,3、平板划线法,方法同光合细菌。 由于单细胞藻类大多不适合在固体培养基中生长，因此，分离效果较差。,Company Logo,二、单细胞藻类的培养方式,（一）纯培养与单种培养： 1、纯培养：纯培养即无菌培养，是指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。 2、单种培养：在生产性培养中是不排除细菌存在的，
9、为了区别而称单种培养。,Company Logo,（二）开放式培养和封闭式培养,1、开放式培养：是把藻类培养在敞开的广口玻璃瓶，水族箱等容器中进行培养，设备简单，为目前主要的培养单细胞藻类的形式。 特点：充足的光照和通风，繁殖迅速。 容易受敌害生物的污染。 2、封闭式培养：在封闭容器中进行培养，仅有充气管，培养液加入管和藻液抽出管与外界有接触，其余不与外界接触。 特点：减少敌害生物污染，成功率高。 生长速度较慢。,Company Logo,（三）一次性培养、半连续培养和连续培养,1、一次性培养：在各种容器中，配制培养液，把少量藻种接种进去，在适宜的环境条件下培养，经过一段时间藻种繁殖达到较高的
10、密度，一次全部收获。 2、半连续培养：半连续培养是在一次性培养的基础上，当培养的藻细胞达到或接近收获的密度时，每天收获藻液的一部分并补充等量的培养液，继续培养。 3、连续培养：一般为室内，人工光源，自动控温，封闭式充气培养。 连续培养能使藻细胞生长繁殖的条件稳定，藻细胞始终处于指数生长期，生长迅速，产量高。,Company Logo,三、培养方法：,（一）培养容器： 三角烧瓶、玻璃钢水槽和水泥池等均可作为单胞藻的培养容器。 （二）容器工具的消毒： 同光合细菌的消毒方法。 （三）培养液的制备： 选择合适的培养液配方，按照配方配制。,Company Logo,（四）接种,1、接种质量：一般要求选取
11、无敌害生物污染，生活力强，生活旺盛的藻种培养。 颜色正常，无大量沉淀和无明显附壁现象。 2、藻种数量: 藻种培养：藻液容量和新配培养液比例为1：2-1：3，一般一瓶藻种可接成3-4瓶。 中继培养和生产性大量培养由于培养容器容量大，藻种供应有时不足，可根据具体情况灵活掌握，但最少不宜低于1：50。 一般以1：10-1：20较适宜。 3、接种时间： 最好在8-10时，不宜在晚上。,Company Logo,（五）培养,1、日常管理 搅拌和充气： 通过搅拌或充气增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，补充由于藻细胞作用对二氧化碳的消耗。 帮助沉淀藻细胞上浮而获得光照。 防止水表面长出菌
12、膜。 搅动、摇动一般每天至少3次，定时进行，每次半分钟。 充气。可24小时连续充气或间歇充气。,Company Logo,调节光照,人工光照： 自然光：极端易变是太阳光源的特点，必须根据天气情况，不断调节光照度。 室内尽可能利用近窗口的漫射光，防止直射光照射，光照过强时可用竹帘或布帘遮光调节。 室外一般应有棚室顶架，用活动白帆布或彩条布蓬调节光照，阴雨天，可短期利用人工光照。,Company Logo,调节温度,一般单胞藻培养不须控温设备，冬季培养应加取暖设备来提高温度。,Company Logo,注意酸碱变化,CO2被吸收利用，导致藻液pH上升。 其他营养物质的吸收，也会引起pH的上升或下降
13、。 如pH过高或过低，可用1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节。,Company Logo,2、培养藻类生长情况观察和检查,藻类的生长情况，可以通过藻液呈现的颜色，藻细胞的运动或是悬浮情况，是否有沉淀和附壁现象； 菌膜和敌害生物污染迹象的有无等观察而了解大概情况。,Company Logo,（六）防治敌害生物的措施,1、预防措施： 严格防止污染： 防止污染的重点应该放在生产性藻种培养这一级上。 因为：藻种培养在室内，培养容器为玻璃瓶。防止污染条件较好。 只要藻种级没有敌害生物污染，扩大培养到水池，生产周期短，就是发生污染敌害生物还需要一段生长、繁殖时间才能达到一定数量，所以影响不大。,Compan
14、y Logo,保持培养藻液的生长优势和数量优势,首先接种的藻种最好取自指数生长期。 接种量大，从培养开始培养藻液在培养液中即占数量上的绝对优势。,Company Logo,做好藻种的分离、培养和供应工作,在培养过程中，严格防止污染是重要的，但从目前单细胞藻类的培养水平看，绝对防止敌害生物污染是不可能的， 要根本的解决这个问题，就必须不断的补充新的“纯”藻种来取代在长期培养过程中已经受污染的藻种，这才可能使培养较好的顺利进行。,Company Logo,2、清除、抑制或杀灭敌害生物的方法,使用过滤方法清除大型敌害生物： 饵料微藻都很小，对污染的大型敌害生物（如轮虫等）可用过滤方法清除。 清除轮虫
15、等敌害生物可用网孔小于60um的密筛绢网过滤，必须连续过滤。,Company Logo,使用药物抑制或杀灭敌害生物,培养亚心形扁藻和湛江等鞭藻出现尖鼻虫危害时，在藻液中加0.003%医用浓氨水，可有效杀死尖鼻虫不影响藻细胞生长繁殖。 如果在藻液中细菌大量繁殖时，致使藻细胞生长缓慢大量下沉，在lL藻液中加入少量青霉素，可抑制细菌的生长。,Company Logo,改变环境条件杀灭敌害生物,利用亚心形扁藻耐高盐的特性，使用提高比重的方法杀灭敌害生物。在被污染的藻液中加入食盐，把藻液比重提高到1.056-1.060，游仆虫等敌害生物可被杀死。 盐藻培养受变形虫危害时，在1000ml藻液中加盐70-1
16、10g能杀死尖鼻虫，游仆虫及个体较小的原生动物。 当亚心形扁藻、湛江等鞭藻中有尖鼻虫、游仆虫等敌害生物时，可以采用盐酸酸化藻液的办法进行杀灭。 方法1000ml藻液中加1mol/L盐酸3ml，边加边搅拌同时测定pH值，待pH降到3时，停止加盐酸，酸化0.5-1h，即可将上述敌害生物杀死。 然后用氢氧化钠将藻液恢复原pH，藻液经23-25h后，就可恢复游动及正常生长繁殖。,Company Logo,四、几种比较特殊的培养方法,（一）同槽培养 在对虾育苗池施肥培养生物饵料供同池培养的对虾幼体食用，生物饵料培养与对虾育苗在同一水池内同时进行，即同槽培养。 1、培养池：水容量大，室外、露天。 2、清池
17、消毒： 3、藻种：从海区抽上来，经沉淀池沉淀的海水，用150目筛娟网过滤后灌入池中。 4、施肥： 第一天氮肥：2-3mg/L、磷肥：0.2-0.3mg/L 以后每天施氮肥：0.5-1.5mg/L、磷肥：0.05-0.15mg/L 铁肥和硅肥不必每天施，隔2-3天施一次或完全不施。 铁肥：0.3-0.5mg/L 硅肥：0.05-0.1mg/L,Company Logo,（二）专池培养,专池培养：与同槽培养不同的是使用专用饵料池培养，施肥量加大，培养时间短浓度大。 1、2、3步骤同上。 4、施肥： 第一次施硝酸钠：30mg/L 磷酸氢二钾：3mg/L 三氯化铁：0.3mg/L 一般三、四天，即可收
18、获。 优点：方法简单、培养速度快，能大量及时的供饵。 缺点：生长起来绝大多数单胞藻不适合蚤状幼体摄食，生长起来又极容易大量死亡。,Company Logo,（三）底栖硅藻的培养,鲍、蛤及海参等海产经济动物的幼虫卵孵出后，只有一短暂的浮游阶段即下沉过底栖生活。在底栖生活阶段需要提供底栖性饵料。 1、藻种的来源： 海区挂板附片：在海区浮筏下，悬挂各种类型的附着基（如文蛤壳、塑料板、玻璃片等），悬挂深度在0.5m左右，2、3天后取回；冲洗去附着杂物，再取下底栖硅藻，收集藻种。 刮砂淘洗：自然繁殖的底栖硅藻在海滩的表面形成黄绿色至黄褐色的密集藻群。取有密集藻群的表面细砂，加入清洁海水，搅拌清洗杂物，静
19、置片刻，待沙泥下沉，上层液体呈茶褐色，在经粗筛娟过滤，即可得到浓度很大的底栖硅藻藻液。,Company Logo,2、培养容器和附片装置,培养容器： 玻璃钢水槽：藻种 水族箱：中继培养 水泥池：大型培养 附片装置 玻璃、聚乙烯薄膜、玻璃钢波纹板等均可作为附片装置。 附片架,Company Logo,3、培养方法,接种附片 把培养容器、培养池和附片装置清洗消毒干净，将幅片装置装入培养容器中，加满过滤海水。 把采集到得底栖硅藻液用密筛娟网过滤1-2次后，倒入培养池中，搅拌均匀，静置1天，利用底栖硅藻在静水中沉降并附片的特性来附片。 24h后，硅藻藻种已比较均匀地附着在附片的向上面，用水轻轻冲洗附片
20、，附片上的硅藻不脱离时，即全部换水，加入新鲜海水并施肥，开始培养。 培养2-3天后，可将附片装置翻转，再一次接种附片，即得双面附片，继续培养。,Company Logo,换水,每2-3天换水一次并施肥，换水时必须冲洗池底污物，并将敌害生物冲走。 在高温季节里，换水次数应增加。 在条件许可时利用循环水或流动水培养底栖硅藻，能获得更理想的效果。,Company Logo,施肥 硝酸铵：10-25mg 九水硅酸钠：1mg 磷酸二氢钾：1-2.5mg 维生素B12：0.25ug 柠檬酸铁：0.1mg 海水1000ml 光照5000-10000lx 生长情况观察 收获：5-7天培养即可收获。 将附片装置
21、用过滤海水轻轻冲洗或在池中荡洗几次，然后整个移入育苗池中，培养的幼虫下沉在附片上，并以附片上的底栖硅藻为饵料。 洗刷：将硅藻从附片上洗刷下来，经过滤后投入育苗池中。,Company Logo,五、藻种的保存,（一）琼脂斜面保存 在微藻培养液中，溶入琼脂，制成1.5%-2%的琼脂斜面固体培养基，划线接种上微藻，在弱光下培养，当目测到藻落形成时，在实验室温下保存或放入冰箱中保存。 优点：时间长，一般为1年左右如果每天让藻种接受短时间弱光照，则可保存2-3年；体积小便于携带和邮寄。 缺点：琼脂斜面易干燥收缩，引起藻细胞变形，重接种时需较长时间恢复。,Company Logo,（二）液体保种,方法与单
22、胞藻的培养基本相同，但是注意以下几点可以延长保种时间。 1、减少接种量： 如中肋骨条藻接种1周就能达到最大生长密度，然后渐渐开始衰败，2周作用就会全部死亡。 这样就必须每周或者10d左右就更新接种一次。 如果在100ml的培养液中，只接种2-3滴藻种在室温和室内自然光照下，需要1个多月才能达到最大密度。 这样就可以在1个月或更长时间更新1次接种即可。,Company Logo,2、加入氮素,以往在微藻保种时，常用降低氮素的浓度来使微藻缓慢生长，延长更新接种的周期。 现在发现微藻细胞分裂率与氮浓度之间有一个双曲线的关系，即在适宜浓度范围内生长率随氮浓度增加而上升，随后趋于平稳，超过适宜浓度范围，
23、生长率反而下降。 所以，如用硝酸钠作氮源，浓度为100mg/L（N）培养微藻可以2-3个月更新接种1次。,Company Logo,3、低温,将指数生长期的微藻，置于家用冰箱（4-5）中，可保存半年左右。 但这种保种方式保存的藻种，更新接种需要15-20天才能正常生长。,Company Logo,思考题,（一）选择 1、大多数单胞藻适合的温度范围是（ ）。 A 20-25 B 25-30 C 30-35 D 35-40 2、大多数单胞藻适宜的pH（ ）。 A 6.07.0 B 7.58.5 C 8.09.0 D 6.09.0 3、生产性培养单胞藻，一般的接种量为（ B ）。 A 1：5-1：7
24、 B 1：10-1：20 C 1：50-1：100 D 1：2-1：3 4、单胞藻培养中，搅拌和充气的最主要的目的是（ ）。 A使二氧化碳溶解到培养液中 B帮助沉淀藻细胞上浮而获得光照。 C防止水表面长出菌膜 D 增加溶解氧,Company Logo,5、单胞藻培养中，预防敌害生物污染的关键在（ ）。 A 中继培养 B 生产性培养 C 藻种培养 D 单胞藻运输与贮存 6、下列条件中哪个不是延长单胞藻液体保种时间的措施（ ）。 A 减少接种量 B 增加二氧化碳 C 增加氮素 D 低温 7、藻种培养，一般的接种量为（ D ）。 A 1：5-1：7 B 1：10-1：20 C 1：50-1：100 D 1：2-1：3,Company Logo,（二）填空 1、一般可采用 、 和 进行单胞藻的分离。 2、钝顶螺旋藻需要的培养条件，温度 、光照 、pH 。 3、单细胞藻类培养过程分为： 、 、 、 。,Company Logo,（三）简答 1、单细胞藻类的培养条件。 2、简要叙述如何采用微吸管分离法分离单胞藻。 3、预防敌害生物进入单胞藻培养池的措施。 4、单细胞藻类的常用保种方法。 5、如何获得底栖硅藻的藻种。,
