1、抗癌三尖杉酯类碱提取技术研究进展摘要：介绍三尖杉酯类碱提取原料，药用性质，通过实验，分析和讨论了三尖杉酯类碱的提取过程,采用无毒、无污染的乙醇作为提取溶剂，然后利用有机物梯度萃取、逆流分布法分离，结合氧化铝柱和薄层层析法对粗提物进行分离提纯，得到了较高纯度的产品。阐述了植物组织培养与内生真菌产三尖杉酯类碱的发展。关键词：三尖杉酯类碱，提取，分离技术1 前言三尖杉酯类碱具有显著的抗癌作用 1,由于它的使用价值和经济价值，近年来国内外对该属植物的化学、药理和临床等方面进行了一系列的研究工作,争相开发， 。已从三尖杉属植物中提取分离出了三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱供临床应用。但由于三尖杉植物资源有限,其
2、中有抗癌活性的酯类生物碱的含量又极低,所以远不能满足临床需要。目前，我国主要是用海南粗榧或中国粗榧和三尖杉这几种树为原料,从中提取有效成分供临床使用。由于树木的大量采伐，导致树种濒临枯危，而且严重破坏生态平衡。因此，寻找新的产三尖杉酯类碱植物资源、开发新的三尖杉生物碱生产提纯分离技术、发现新的有效或可以用作半合成的化合物对深入三尖杉酯类碱的研究、提高有限资源的利用率都有十分重要的意义。1963年，Paudler等首次从三尖杉和日本粗榧植物中分离得到三尖杉酯碱及三尖杉碱，直到1969年，Powell等才确定了它们的结构 2。我国也于2O世纪7O年代初在全国范围内组织三尖杉研究协作组，对分布在我国
3、境内的8种三尖杉植物进行生物碱资源普查，内容包括各种三尖杉酯碱的提取分离、结构鉴定和抑癌作用的研究。至2O世纪7O年代末，已经分离鉴定了2O多种生物碱，其中广泛研究的是三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱。它们对动物转移性白血病P一388、L一1210有抑制作用。临床上三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱配合其它中药治疗各种类型白血病均有较好疗效，对白血病治疗缓解率达82 3。目前对非淋巴性白血病主要采取以三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱为主的联合化疗治疗方案，经多年临床证明，疗效显著；同时，三尖杉酯碱还可用于治疗黑素瘤、肺癌、乳腺癌、脑肿瘤等。因此，三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱被列入全世界36种抗
4、癌药物之列，在国际市场上每公斤售价达24万美元。2 三尖杉酯类碱提纯分离由于三尖杉酯类碱在粗榧属植物的根、叶、枝、种子广泛存在，但含量有所差别，因此现阶段对三尖杉酯类碱，如高三尖杉酯碱、三尖杉酯碱的提取分离，大多以树皮为原料，而提取分离技术在其中扮演着重要的角色。根据三尖杉酯类碱的结构和性质，采取溶剂提取和柱层层析分离法是目前较为常用的方法。3 以三尖杉酯碱的提取分离为例进行说明。（1）材料与方法供试材料三尖杉(采自福建省大田县梅林林场)（2）主要仪器索氏提取器、高效液相色谱仪、FinniganLCQ离子肼质谱仪、Nicolot Magna 750傅立叶变换红外光谱仪、Lsmbda 35 Si
5、mulation紫外可见分光光度计、UNITY 500核磁共振仪。（3）方法标准品制备取从中国药品生物制品检定所购买的三尖杉酯碱(鉴别用)，用甲醇溶解成lmgmL，即得三尖杉酯碱的标准品溶液。（4） 薄层层析板的手工铺制 用硅胶G、0.5 羧甲基纤维素钠和氢氧化钠溶液(1molL)制成的碱性薄层层析板于105的烘箱中活化1h后置于干燥器中备用 4。（5） 鉴定样品液的提取、分离与纯化回流提取取三尖杉枝叶粗粉4份，每份5g，分别置索氏提取器加85的乙醇80mL，加热回流至无色，提取液合并置浓缩器中，减压浓缩回收乙醇至流浸膏1。梯度萃取将流浸膏用5醋酸溶解，浓氨水调节pH值。用氯仿在pH=3、6,
6、9时梯度萃取。pH=3、9的萃取物为杂质，另浓缩；pH=6的氯仿萃取液减压浓缩至膏，为所要的总生物碱 4。逆流分布法分离三尖杉酯碱用柠檬酸和磷酸氢二钠配制pH=4左右的缓冲液为固定相，流动相为氯仿，二相互相饱和。用流动相把pH=6获得的样品溶解，放在分离器中进行逆流分布，用薄层跟踪检查各分离器的上、下层溶液，至获得三尖杉酯碱的单一成分的粗制品时分别收集，待精制 5。（6）精制吸附柱层析法 用A1 2O3作吸附剂，将三尖杉酯碱抽松后的粗品用适量二氯甲烷溶解上柱，用乙醚洗脱，等量收集流出液，流出液用薄层检查，得较纯的三尖杉酯碱 6。（7）薄层层析检测 取132制备的活化过的碱性层析板，用三尖杉酯碱
7、样品液和三尖杉酯碱标准品液进行点样，用展开剂(三氯甲烷：甲醇=7：05)展开，用一块干净的玻璃板盖住右边样品点，然后用05高锰酸钾溶液进行显色，呈红棕色斑点。将层析板上右边未显色且与标准品液同一高度位置的样品液点挖下来，再重复上述方法，合并10块层析板上挖下来的样品液点，用甲醇溶解后过滤，再用甲醇定容成2 mL，即得纯的样品溶液，即得纯的样品溶液 7。（8）三尖杉药用成分光谱鉴定 8将三尖杉酯碱标准品溶液和提纯的样品溶液进行质谱、红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱四大光谱测试。通过四大光谱分析方法，比对标准溶液与样品提取液的吸收峰，可以看出所采集的三尖杉植物体内含有三尖杉酯碱成分。本研究特点是得
8、到三尖杉酯碱的纯物质，直接与标准品进行四大光谱鉴定，不同于别的研究(得到总生物碱，再进行官能团分析，确定生物碱的结构)。由于三尖杉资源的宝贵，所以实验取的样品的量比较少，主要是做分离和纯化工作，加上薄层层析所点样的量局限，因此所得有效成分的浓度还不够高，四大光谱图的谱线还不够清晰，需要研究者进一步工作。4 粗榧属植株组织培养提取三尖杉酯类碱粗榧科植物三尖杉组织培养株中含有高三尖杉酯碱,且以草本植物愈伤组织块的培养株含量最高。草本植物的组织培养株可能成为中药三尖杉的一种重要代用新药源。耿莹莹 9等通过高效液相色谱法对高三尖杉酯碱进行了提取分离鉴定，实验方法中选择1:1的氨水游离高三尖杉酯碱,并用
9、氯仿提取出来,用溶解度较好的甲醇溶解后测定。这是因为高三尖杉酯碱属生物碱,易溶于乙醇、甲醇、氯仿、乙醚,在弱碱性条件下呈游离状态,有文献报道先用5%醋酸溶解,再用浓氨水调pH为6时,用氯仿萃取总生物碱,最后提纯。色谱条件-用色谱柱:Hypersil BDS(40 mm250 mm,5m);流动相:0.000 8 molL-1碳酸铵溶液-甲醇(4258);柱温:室温。检测波长:290 nm;流速1.0 mLmin-1。进样量:20L。理论板数按样品计算为1207。所以，草本植物组织培养株粉末中高三尖杉酯碱的含量虽然不高,但除培养株根部的含量比三尖杉树皮的低之外,其余的高三尖杉酯碱含量均比药材高,
10、特别是冬季的草本植物组织培养株,其高三尖杉酯碱的含量高达0.105 mgg-1,比三尖杉树皮的高将近十倍,这可初步为草本植物组织培养株的应用提供依据,为寻找三尖杉新药源提供一个可行性思路。5 内生真菌 gyzy-20 生产高三尖杉酯碱根据植物内生真菌在与宿主长期协同进化中，往往具有生产类似活性物质的能力，韩洁等 10通过HPLC对内生真菌代谢产物进行提取和鉴定，并进一步对发酵和提取工艺进行优化，以期充分发掘篦子三尖杉内生真菌的药用价值，为其深入研究提供可能。菌株gyzy一20产HHT的HPLC分析。将菌株gyzy-20接种至装有60 ml液体PDA的150 ml三角瓶中，室温下 130rmin
11、振荡培养，7 d后观察菌株gyzy20的形态特征。并超声破碎发酵液中的菌丝球。其中，超声时间为4 min，打击时间为4 s，间隔时间为4 s，超声功率为400 W。收集发酵液， 5 000 rmin离心15 min，取上清液，在60 水浴中浓缩2O倍体积，加入无水Na 2CO3，调pH值为9，补充相同体积的二氯甲烷，充分混合后静置1 h以上； 5 000 rmin离心15 min，取下层有机相，自然挥干后，用3ml甲醇溶解定容至刻度，用HPLC仪在波长291 nm处进行分析。药用植物次生代谢产物的含量普遍很低，目前HHT在三尖杉枝叶或悬浮细胞中的提取量均低于O.01 11,12，内生真菌产HH
12、T量也比较低。鉴于微生物发酵具有规模化和集约化优势，该研究对菌株的发酵及萃取条件进行优化，发现萃取时间对HHT含量的影响较大，优化后发酵液中HHT含量可提高1.5倍以上，达到0.26 gml。6 三尖杉酯类碱提取方法总结以上对三尖杉酯类碱进行了提取分离分析实验，以树皮、植物组培抑或是内生真菌产三尖杉酯类碱，用的都是传统的有机溶剂提取法。三尖杉酯类碱的提取过程可分为粗提与纯化两个阶段，粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标化合物，所得物料再进行后续提纯直至获得纯品。粗提过程可分为初级萃取和次级萃取，两种过程因所用溶剂不同故可除去不同的杂质。6.1 初级萃取初级萃取主要是用甲醇、乙醇或二氯
13、甲烷一水进行浸提，一般浸提时间较长，具体视原料的粉碎程度而定。浸提完后，可以将溶剂回收。所得浸膏用来进行次级萃取。余广鳌等 13通过研究发现，在浸提过程中，如果使用单一溶剂，则甲醇浸提效果最好。如-使用混合溶剂，要达到好的浸提效果，甲醇或乙醇等高极性有机溶剂不可缺少。参照徐礼桑等 14用甲醇一二氯甲烷(95:5)作初级溶剂，所需萃取时间为35一6omni。在溶剂系统不变的情况下，将原料与溶剂的混合物进行超声振荡，萃取达到平衡的时间缩短到仅5min。在三尖杉酯碱初级萃取过程中引入超声技术，可大大缩短初级萃取的时间。6.2 次级萃取次级萃取除了可以采用各种有机溶剂进行液液萃取外，还可以采用固相萃取
14、法和超临界流体萃取法等。（1） 液一液萃取液液萃取法是最常用的现阶段三尖杉酯碱常用的粗提方法。通常是用二氯甲烷一水或三氯甲烷一水对上述浸膏进行分配萃取。这种方法简单易行，但所得产物杂质较多。（2） 固相萃取尽管在对粗榧属三尖杉植物进行粗提时大量使用了液液萃取法，而且技术也较为成熟，但固相萃取法与其相比仍具有某些独特的优点，它利用固相吸附剂去掉浸提液中的某些杂质，相当于首先进行了一次色谱纯化。因而可达到节省时间，降低有机溶剂用量，提高选择性和回收率等目的。（3） 超临界流体萃取上述方法提取三尖杉酯碱通常需要大量的有机溶剂，回收利用困难。为了减少污染，超临界流体萃取法(SFE)可以考虑用来提取紫衫
15、醇的研究，利用二氧化碳和乙醇的混合物为超临界流体，选择性也可能好的多。SFE中最常用的超临界流体是二氧化碳 15，另外还有人使用N 2o和N 2o一乙醇的混合溶剂作为超临界流体 16。该方法的不足之处是对仪器设备要求较高，限制了其应用。而Aollla等人 17将超声技术引入到初级萃取，研究发现，采用超声技术，可以在低温下进行操作，这样可以避免三尖杉酯类碱在温度高时可能发生的异构化。WO94一122618描述了一种采用半透膜和反渗透装置分离紫杉醇的方法，膜组件形式为平板式、中空纤维式和管式，结果发现可以进一步浓缩粗提工艺获得的浸膏，使紫杉烷类物质的浓度提高5倍左右，相当对浸膏又进行了一次预处理，
16、这样可以减少色谱分离的压力。因此，在三尖杉酯类碱的提取中，在修改膜参数的基础上，反复试验，找到最佳工艺参数，同样可以使用。但该方法需要昂贵的半透膜和反渗透装置，同时也需要复杂的操作技术。7 实验室获得三尖杉酯碱提取技术（1）回流提取法使用的回流溶剂一般有水、醇及混合溶剂。此法操作简便，但效率不够高，有时可能不能一次完全提取生物碱，要反复回流提取。（2）索氏提取法即利用索氏提取器，多次提取生物碱，可以反复利用溶剂，提取效率高且操作方便。索氏提取生物碱的方法已为人们广泛利用。（3）pH梯度萃取pH梯度萃取分离就是根据不同物质在不同pH下析出沉淀的原理来提纯所需物质pH梯度萃取法是分离酸性、碱性、两
17、性成分常用的手段。其原理是由于溶剂系统pH变化改变了它们的存在状态（游离型或解离型） ，从而改变了它们在溶剂系统中的分配系数。试验中提取三尖杉酯碱就是用浓氨水对溶于5%醋酸中的生物碱进行氯仿提取，使pH=6时，提取出粗碱，除去大部分杂质，萃取液进一步减压浓缩得到总生物碱浸提膏。从而进一步对其进行精制。（4）逆 流 分 布 法又 称 逆 流 分 配 法 、 逆 流 分 布 法 或 反 流 分 布 法 。 利 用 不 同 物 质 在 两 个 互 不相 溶 的 溶 剂 中 溶 解 度 不 同 的 原 理 使 混 合 物 分 离 的 方 法 。 此 法 相 当 于 多 次 萃 取 。利 用 此 原 理
18、 制 成 了 连 续 、 自 动 的 逆 流 分 溶 仪 。 该 仪 器 可 使 两 种 性 质 相 似 、 即使 分 溶 常 数 很 接 近 的 化 合 物 ， 经 过 一 定 次 数 振 摇 、 转 移 的 操 作 ， 亦 可 达 到 分离 的 目 的 。（ 5） 吸 附 柱 层 析 法吸 附 柱 层 析 是 以 固 体 吸 附 剂 为 固 定 相 ， 以 有 机 溶 剂 或 缓 冲 液 为 流 动 相 构成 柱 的 一 种 层 析 方 法 。 其 原 理 是 利 用 吸 附 剂 对 混 合 试 样 各 组 分 的 吸 附 力 不 同而 使 各 组 分 分 离 。 当 采 用 溶 剂 洗
19、脱 时 ， 发 生 一 系 列 吸 附 解 吸 再 吸 附 再 解 吸 的 过 程 ， 吸 附 力 较 强 的 组 分 ， 移 动 的 距 离 小 ， 后 出 柱 ； 吸 附 力 较 弱 的组 分 ， 移 动 的 距 离 大 ， 先 出 柱 。8 未来可应用的提取三尖杉酯碱技术（1）超声波提取法本法一般作为生物碱的辅助提取法，单纯采用超声波法提取并不多见。李慧等使用超声波辅助浸提北草乌生物碱，可以大大提高生物碱的提取收率，缩短浸提时间，并且能很好地保持生物碱的特性和品质。（2）膜提取法膜提取分离是一门高新技术，在对中草药的提取浓缩、生物碱的提取分离及其他有效成分的提取分离中，具有不存在相转换、操作条件温和、提取分离效率高、不必添加化学试剂、不损坏热敏感物质、可极大地简化提取工艺等优点，具有传统方法无可比拟的优势。9 结束语随着我国粗榧科植物资源的深入开发和国际交流的进一步扩大，必将为三尖杉酯类碱萃取技术提供更好的发展契机，而相关的新型萃取技术的发展也无疑会给萃取三尖杉酯类碱技术的研究注入新的活力，并不断提出新的研究课题，促进该项技术的理论研究、应用与发展。
