1、漯河职业技术学院食品工程系毕业论文1正文随着我国乳品工业的迅速发展, 奶源的需要量日益增大, 而乳品掺假现象也日益严重。在众多掺假检测中, 复原乳的检测越来越受到人们的重视。复原乳又称还原乳, 是指把牛奶浓缩、干燥成为浓缩乳或乳粉, 再添加适量水, 制成与原乳中水、固形物含量相当的乳液, 其营养价值却低于鲜乳。因此对复原乳的监测就十分必要, 本文就国内外复原乳检测方法的研究进展和发展进行综述。1 复原乳检测指标研究现状1.1 乳中的荧光物质和脂肪酸组分牛乳中含有多种荧光物质, 其中有生乳本身所含有的 , 如色氨酸, 还有牛乳在加工和贮藏过程中所产生的。奶粉或灭菌乳在加热处理或者长时间贮藏过程中
2、会发生羰胺反应, 产生的新的荧光物质如糠氨酸, 且其含量会随着贮藏时间的延长而逐渐上升。可以利用此物质荧光值的上升程度来测定复原乳的添加量。样品经过适当的前处理, 利用荧光分光光度计, 将荧光谱图做一次微分图, 根据图形的不同,鲜乳与复原乳可加以区分, 利用此方法对市售鲜乳曾进行调查, 效果良好, 但是冬季剩余乳所制成高温长时灭菌乳, 再混入 UHT 鲜乳, 则此法就失去效率, 另一方面这方法不适合测试酪乳中是否有添加复原乳, 因为这种测试也受泌乳期影响, 泌乳初期乳中含较高固醇类荷尔蒙有荧光性质类似复原乳荧光,易导致判断失误。最近利用酪蛋白在碱性溶液中复原乳与生乳之间有不同荧光光谱, 有待进
3、一步探讨其能否应用在鲜乳与复原乳的区分方法上。在长储存期的奶粉制作过程中, 脂肪降解是一个突出的问题, 但利用气相色谱法分析牛奶中脂肪酸组成分的变化来鉴别鲜奶与复原乳结果不够理想。主要原因为乳牛泌乳期不同, 牛乳中脂肪酸组成分会有所改变, 另一方面全脂乳粉制成鲜乳较容易区分, 因脂肪与蛋白质有结合现象, 利用红外线分光光谱就可测出, 主要难题是脱脂乳粉制成复原乳比较难于鉴别, 这也是目前有争议的部分。1.2 牛奶加热处理的产物近几年来, 复原乳以及加热过度的检测指标主要集中在奶制品经热处理后产生的热损害产物, 即新生成的物质。为达到卫生学安全并延长货架期的同时, 避免发生其他不良变化, 热处理
4、的条件必须控制在一定范围内。因此, 定量检测终产品中的热处复原乳检验方法及发展研究2理产物以及适宜的检测方法是非常重要的, 这也可以用于衡量牛奶的营养价值的损失。如果热处理过程中发生了不可逆反应, 则可通过对热损害产物的评价来选择适宜指标。研究热点主要集中在所发生生物化学反应上。这些物质可归结为如下两类: (1)热降解产物: 热不稳定组分的降解、变性、失活, 如乳清蛋白或酶; (2)新形成物质: 如由乳糖异构产生的乳果糖或糖与氨基酸发生美拉德反应生成的产物糠氨酸以及赖氨酸和丙氨酸交联产生的赖丙氨酸等新物质。2 复原乳检测的方法研究现状2.1 荧光分光光度法检测复原乳利用荧光分光光度计, 将荧光
5、光谱图做微分图,由图形不同, 可区分鲜乳与复原乳。泌乳初期乳中含较高固醇类荷尔蒙有荧光性质类似复原乳荧光, 故易导致判断失误。最近利用酪蛋白在碱性溶液中复原乳与鲜乳之间有不同荧光光谱, 有待进一步探讨其在鲜乳与复原乳鉴上的应用。可以根据荧光上升程度测定复原乳的添加量。其试验方案为: 待检验牛乳加乙酸钠缓冲溶液 调 pH 值到 4.6 使蛋白沉淀振荡离心取上清液滤膜过滤稀释 50 倍荧光检测。浙江大学的叶兴乾研究用 FAST 荧光方法检测了复原乳。检测的指标是牛乳中的可溶性的荧光物质 AMP 和 TRP。2.2 紫外分光光度法检测复原乳乳清蛋白通常被用来作为热损害的指示指标,重要的是乳清蛋白氮指
6、数(WPNI)和热指数。WPNI 是未变性的乳清蛋白氮(可溶于饱和 NaCl),以 mg/g 奶粉或液态奶表示, 可用浊度计测定。热指数可用 pH 值为 4.6 时不溶性氮的百分数表示。根据乳清蛋白热变性的程度可鉴别复原乳和鲜奶。该方法在应用上存在很多困难, 主要由于乳成分之间差异和杀菌方法、温度和时间的不同导致差异较大, 因此很难单纯地用鲜奶中个别成分的变化区分复原乳。刘晶、韩清波等人用紫外分光光度法鉴别复原奶和保鲜奶的方法。对保鲜奶和复原奶中未变性乳清蛋白质量浓度的差别进行研究, 初步探索了以紫外分光光度法对二者进行快速鉴别的方法。通过对未变性乳清蛋白的吸光度的研究确定了它的最大吸收波长为
7、 292nm, 可在此波长下测出它的吸光度值并由标准曲线的线性回归方程算得其质量浓度。结果表明, 复原奶中的未变性乳清蛋白质量浓度与保鲜奶中未变性乳清蛋白质量浓度差异较大。但该方法检测限较高, 受生奶来源影响较大。2.3 电化学感应器检测复原乳漯河职业技术学院食品工程系毕业论文3M. S. Cosio 等人通过用电化学感应器检测游离巯基来评价牛乳加热的强度。先调节牛乳的 pH 值到酪蛋白的等电点 4.6,使乳中的酪蛋白沉淀,然后用电极检测上层清液中的游离巯基。该方法适用于快速区分不同加热方式的牛奶,因为酸溶性的乳清蛋白的量与牛奶的加热强度密切相关, 该方法得到的结果与分光光度法得到的结果有很强
8、的相关性。N.Parris 等人用反相高效液相色谱定量检测了 63、74、85条件下 -乳白蛋白和 - 乳球蛋白的含量, 发现随着温度的升高,- 乳白蛋白和 - 乳球蛋白的含量显著下降。乳粉的品质会对复原乳的检测结果产生很大的影响。乳粉等级是依乳清蛋白氮(whey proteinnitrogen) 含量来区分,少于 1.5 mg/g 为高温乳粉(highheat), 1.51 5.99 mg/g 为中温乳粉(medium heat),6.0 mg/g 以上为低温乳粉, 而这些当中又因乳粉贮藏的温度及时间而有所变动。这些不同种类乳粉所制造复原乳, 性质上大不相同, 有的溶解度高, 有的溶解度低。
9、检验鲜乳中添加复原乳含量或是否有掺假并不是单纯一项测定试验。2.4 通过高效液相色谱法测定糠氨酸检测复原乳国外糠氨酸的测定采用的方法主要有反相高效液相 HPLC 法、氨基酸分析法、还有液质联机 HPLC-MS 法。最近也有国外学者报道, 前表面荧光光谱法可同时检测糠氨酸和乳果糖。对比利时市场消费的各种奶类共 154 种样品进行检测, 结果证实: 低温巴氏、高温巴氏杀菌奶中热损害产物糠氨酸和乳果糖的含量极低, 而在直接和间接 UHT 奶以及灭菌奶中的糠氨酸和乳果糖含量大大增加, 并呈依次递增的趋势;每 100g 蛋白质中糠氨酸的含量, 巴氏杀菌奶为 3.811.9mg;不同 UHT 灭菌乳中糠氨
10、酸含量差异较大, UHT 奶中糠氨酸含量为 43213.5mg, UHT 脱脂奶为 57.963.1 mg,一般在40190mg。2005 年 9 月 30 日农业部出台了巴氏杀菌乳和 UHT 乳中复原乳的鉴定 (中华人民共和国农业行业标准 NY/T939-2005)。由中国农科院畜牧所起草, 其采用的方法为高效液相色谱和酶法检验乳中的糠氨酸和乳果糖, 前处理操作相对比较麻烦。对于巴氏杀菌乳: 当巴氏杀菌乳每 100g 蛋白质中糠氨酸含量大于 12mg 时, 则鉴定其中含有复原乳。2.5 通过高效液相色谱法或者酶法测定乳果糖的检测复原乳在研究奶制品的热损害时, 乳果糖是一个非常有用的指标: 可
11、通过液相色谱、气相色谱和酶水解等方法测定乳果糖的含量, 进而区分鉴别巴氏杀菌奶、UHT 奶和灭菌奶。UHT 奶中的乳果糖质量浓度应低于 600mg/L,灭菌奶中的乳果糖质量浓度高于 600mg/L。复原乳检验方法及发展研究4巴杀菌奶中的乳果糖应低于检测限值, 而在高温巴氏杀菌奶中不应超过 50mg/L。牛奶在加热处理过程中, 部分乳糖异构为乳果糖, 可以通过经 -D-半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖, 通过酶法测定产生的果糖量计算牛乳中乳果糖的含量。RenzoMarsilio等人用固相萃取进行前处理, 阳离子交换色谱蒸发光散射检测器,并采用内标法精确地检测了乳果糖。Simon C. Flemi
12、ng 等人用阴离子交换色谱和脉冲安培检测器检测了乳果糖的含量。2.6 赖丙氨酸的检测L. Pellegrino 等人用高效液相色谱法分析了赖丙氨酸的含量,采用的方法是高温酸水解,固相萃取,然后用氯甲酸- 9-芴基甲酯进行衍生, C18 反相色谱柱分离, 采用荧光检测器进行检测。3 复原乳检测方法的发展研究目前， 检测界对复原乳进行鉴定的通用方法是农业部颁布的农业标准 NYT9392005巴氏杀菌乳和 UHT 灭菌乳中复原乳的鉴定 。 该方法的鉴定标准是通过测定液态乳中糠氨酸和乳果糖的含量来判定样品中是否含有复原乳的。乳制品中的糠氨酸，是乳蛋白质在高温条件下与乳糖发生 “美拉德反应” 所产生的系
13、列产物之一，鲜乳里的糠氨酸含量微乎其微，且不受乳牛处在正常饲养范围内的条件变化影响，而经过高温干燥工艺的乳粉含有大于 135mg/100g 的糠氨酸。所以用液态乳中糠氨酸的含量来判定其是否含有复原乳具有一定的科学性和合理性，但是有以下几方面因素可能会影响到判定结果，有待商榷。笔者希望在此能与相关质检部门进行商榷复原乳检测的方法；同时希望通过与食品企业的检测人员一起探讨， 以引导企业对此有一定的认识， 若遇到可能的误判异议，相关结论可以作为技术依据。标准判定依据应更多考虑国情。该标准的判定依据基本上都是由标准工艺、标准温度计算得来的，而此标准条件主要来源于国外，所以应该考虑中国国情和企业具体条件
14、可能造成的误差。比如在高温灭菌过程中有些企业有 “背压” 回流的工艺，这样就会造成回流部分的液态乳再次经过 137/5s 的杀菌过程；还有一种情况就是，在生产过程中也会存在着灌装设备故障停顿间瞬，同样会增大回流量，以至于液态乳反复受热杀菌，发生剧烈的美拉德反应， 导致糠氨酸含量超标，使得判定结果出现偏差。此外，在液态乳工艺中标准化过程需要添加少量乳粉或闪蒸浓缩来达到目的，这两个途径同样会造成糠氨酸含量的增加而得出含有复原乳的判定，这也与国家所要求禁止漯河职业技术学院食品工程系毕业论文5的复原乳概念不相符。糠氨酸测定易出现偏差在糠氨酸测定过程中，有一个对样品加热水解的过程，如果控制不好，就容易产
15、生糠氨酸而造成判断偏差。步骤如下：试样水解液的制备，吸取 200mL 试样，置于密闭的耐热试管中，加入 6mL 的 106molL 盐酸溶液，混匀；向试管中缓慢通入高纯度氮气 1-2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱中，在 110下加热水解 23-24h；约 1h 后，轻轻摇动试管。由此可见，糠氨酸测定对环境条件要求非常高， 在实验过程中如果环境条件不好或者密闭不严，都会发生反应而生成糠氨酸，从而造成误判。兑水稀释易使结果存在争议该方法的判定是根据完全由乳粉兑水成原料乳进行加工而计算出来的。而实际情况是，如果在鲜乳原料中掺入部分乳粉，只要比例合适，高温时间不延时，通过测定糠氨酸含量会得出非复
16、原乳的判定。这是因为乳粉含有的糠氨酸被稀释了，而后续的高温灭菌工艺又没有额外增加热量。综上所述，影响该方法标准判定的不确定因素较多， 所以最终结果的表述还有待斟酌。近两年来关于复原乳的误判现象屡见不鲜足以说明该鉴定方法存在很多问题，笔者所在的食品检测中心， 经常收到企业对相关的样品进行复原乳鉴定的申请。不少企业委托送样时明确表示他们的样品肯定不是复原乳，但检验结果显示样品糠氨酸超标。 原因是鲜乳加工工艺中存在的高温过程，使非复原乳产生了糠氨酸。4 总结牛乳中含有多种营养物质, 但是复原乳的营养成分与正常乳相比有较大损失, 其中蛋白质、氨基酸、维生素和糖类的效价降低, 特别是乳清蛋白中的各种功能
17、性成分, 如免疫球蛋白、乳铁蛋白等的生物利用率降低。然而一些企业以还原乳冒充鲜奶却未作标识而出售, 损害了消费者的知情权。因此, 选择适宜的鉴别指标, 确定并完善复原乳的鉴定方法, 不但可以为质量监督检验机构的检测和执法监督工作提供理论依据和技术支持, 而且可以有效地保护消费者的知情权 , 使我国乳品市场更加规范化, 同时可以提高乳品企业的竞争力。复原乳检验方法及发展研究6参考文献1 RLpez - Fandi o. Review: Selected indicators of thequality of thermal processed milk Revisi n1999,5(2):121
18、- 137.2 金瑛,刘艳 琴.复原乳鉴别指标探讨.中国乳品工业,2006,(8):43- 46.3 Birlouez - Aragon I, Nicolas M, Marchon N. A rapidfluorimetric method to estimate the heat treatment ofliquid milk. International Dairy Journal,1998,(8),771- 777.4 卜登攀,李 树聪.FAST 指数在复原乳区分中的应用初探.中国农学通报,2006,22(11).5 Burton H. Reviews of the prosess of
19、 dairy science:bacteriological, chemistry, biochemical and physical chan-ges that occur in milk at temprature 100150 J. JDairy Reseach,1984,51:341- 363.6 刘晶,韩清波 .紫外分光光度法鉴别复原奶和保鲜奶J.中国乳品工业,2006,33(12).7 M S Cosio,S Mannin,S Buratti,Electrochemical SensorDetecting Free Sulfhydryl Groups: Evaluation of
20、MilkHeat Treatment,J Dairy Sci,2000,83:1933- 1938.8 N Parris, M A Baginski. A Rapid Method for the Deter-mination of Whey Protein Denaturation. J Dairy Sci,1991,74:58- 64.9 Resm Nip, Pellegrino L, Batelli G. Accurate quan -tification of furosine in milk and Dairy production by adirect HPLC method J.
21、 Italy Journal of Food Science,1990,(2):173- 183.10 Andrews G. Lactulose in heated milk. Bull int Dairy Fed,1989,238:45- 52.11 Asylbek Kulmyrzave, Eric Dufour. Determination oflactulose and furosine in milk using front - face fluore -scence spectroscopy. Lait,2002,82:725- 735.12 De Block J, Merchier
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23、 Sci,1996,79:725- 734.漯河职业技术学院食品工程系毕业论文7致谢复原乳检验方法及发展研究8在本文完成之际，无论我的设计是否能够真的投入使用，这里面每一个控件的绘制，每一行语句的调试，每一段文本的输入之中都有我辛勤的汗水。半年的设计时间虽然短暂，我却从中学到了很多的东西。我由衷地感谢关怀、教诲、帮助、支持和鼓励我完成学业的老师、朋友和亲人。 特别感谢我的导师王林山，半年来他在学习、科研上一直对我悉心指导，严格要求、热情鼓励，为我创造了很多锻炼提高的机会。王林山老师洞察全局、高屋建瓴，为我的论文的顺利完成指出了很好的方向，王林山老师渊博的知识、宽广无私的胸怀、夜以继日的工作态度、对事业的执著追求、诲人不倦的教师风范和对问题的敏锐观察力，都将使我毕生受益。 在此我谨向我的导师以及在毕业设计过程中给予我很大帮助的老师、同学们致以最诚挚的谢意。
