1、1. HPLC 法测定大鼠血浆中的山奈酚1.1 目的要求1. 掌握血浆样品的前处理方法。2. 熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。3. 熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。1.2 主要实验材料与仪器山奈酚（Kaempferol）及其对照品，黄芩素（baicalein） ，抗坏血酸，肝素，-葡萄糖醛酸苷酶（-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase） ，分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min 台式离心机，不同规格移液枪（5, 20, 50, 100, 200, 1000L）和容量瓶（1
2、0，25mL） ，510mL 具塞离心管若干；雄性 SD 大鼠（180220g ） 。1.3 实验原理山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得，故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。实验以黄芩素为内标，HPLC 法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。1.4 实验方法1.色谱条件：C 18 柱（250mm4.6mm ，5m ） ，配保护柱，柱温40；乙腈 -0.5%冰醋酸（ 35:65）为流动相，流速 1mL/min；检测波长 370nm；进样量 20L。2.溶液配制：
3、取山奈酚对照品约 2.5mg，精密称定，置 25mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取适量，分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20 和 30g/mL 的标准系列溶液，置 4冰箱保存。另取黄芩素适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL 的溶液，精密吸取 1.5mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇定容，得内标溶液，置 4冰箱保存。3.血浆样品处理：取大鼠血浆样品 120L，加入甲醇 20L、1%冰醋酸（含 2mg/mL 抗坏血酸） 32L、- 葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（ 6U/mL）的混合水溶液 50L，37水浴温育 30min 后，加入内标溶液 50L，然
4、后加无水乙醚 2mL，漩涡混合5min，于 12000r/min 离心 5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用 100L甲醇复溶，12000r/min 离心 5min，取上清液进样分析。4.专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品，按“ 血浆样处理 ”项下方法处理，照 “色谱条件”项下方法进样测定。比较所得色谱图，考察血浆内源性物质是否干扰测定，药物及内标是否达到基线分离。若有必要，适当调整色谱条件，已达到专属性要求。5.标准曲线制备：精密吸取 120L大鼠空白血浆 9 份，分别加入 20L不同浓度的标准系列溶液，制得 0.0（空白） 、0.0（空白+内标） 、0.05
5、、0.1、0.5、1.5、3 和 5g/mL 的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度点平行 35 份） 。按“ 血浆样品处理” 项下自“加 1%冰醋酸32L”起，同法处理后进样分析，记录峰面积。以山奈酚与内标峰面积的比值（R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回归（两个空白不计入回归曲线，仅作为对干扰的考察） ，求得回归方程（R=bC+a）和相关系数（r） 。并取各浓度点实测值代入回归方程得回归值（C）,与标示值（C）比较，计算偏差（偏差%= ）和准%10C确度（准确度= C/C100%） 。根据上述结果确定线性范围与定量下限（LLOQ ） 。6.回收率和精密度试验：精密吸取 120L大鼠空白血浆，分别加
6、入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制低、中、高（0.1、1、4g/mL ）三种浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行 5份，按“标准曲线制备” 项下方法进行处理、测定。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线，求出测得浓度。计算测得浓度与加入浓度的比值，得方法回收率，并计算各浓度点的相对标准差（RSD） ，作为日间精密度；于不同日（至少 3d）重复上述测定，计算日间精密度。7.萃取回收率试验：精密吸取 120L大鼠空白血浆，分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制 0.1，1 和 4g/mL 浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行 5 份，按“标准曲线制备” 项下方法进行处理，记录山奈酚峰和内标峰面积，作为萃取
7、后的测定值。另取上述低、中、高同样浓度的山奈酚甲醇液，加同样量内标溶液，混合，直接于氮气流下挥干，残留物用 100L甲醇复溶， 12000r/min 离心5min，取同样量上清液进样分析，获得山奈酚峰和内标峰面积，作为未萃取的测定值。采用外标法计算萃取后山奈酚峰面积与相应浓度的未经萃取的山奈酚峰面积比值，得山奈酚萃取回收率；同法计算内标的萃取回收率。8. 稳定性实验：精密吸取 120L大鼠空白血浆，按“回收率和精密度试验” 项下方法配低、中、高浓度的山奈酚血浆样品。考察其在室温下放置 24h（6，12，24h 取样） 、-20 下长期冻存 1 个月（10，20，30d 取样） 、反复冻融（-2
8、0 室温）3 次的稳定性，将测得结果与 0 时的结果进行比较，计算 RSD。并考察测定溶液的稳定性，即样品制备后到进样分析的放置时间（6，12，24，36，48h）的稳定性。9.血浆样品测定：将山奈酚按 1mgkg 的剂量尾静脉给予禁食12h 的 SD 大鼠，于给药前（0min ）和给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240min 分别从眼眶采0.4mL 血，8000rmin 离心 5min，分离血浆。按“血浆处理方法”项下方法处理后，在 HPLC 上进样分析，记录峰面积。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线，计算血浆中山奈酚的浓度，绘制药-时曲线。1.5 注意事项1
9、.山奈酚和内标多为多羟基化合物，对光、热不稳定，测定时应注意避光操作。2.大鼠眼眶采血容易控制采血的时间周期，采血质量高，而且不受是否尾静脉注射给药的影响，故这种采血方法相对优于尾静脉注射。3.当线性范围较宽时，宜采用加权最小二乘法进行回归计算，以使低浓度结果较正确。LLOQ 偏离标准浓度应 20%，其他各点偏离标准浓度应15%，r0.09.山奈酚和内标的萃取回收率应接近，差异不超过10%。1.6 参考文献田杨,蒋学华,杨平,等. HPLC 测定大鼠血浆中山奈酚.华西药学杂志, 2008,23(3):357.2 HPLC-MSMS 法测定人尿中左氧氟沙星浓度2.1 目的要求1.掌握尿样测定的前
10、处理方法。2.掌握 LC-MS 测定中基质效应和专属性的考察方法。3.熟悉 LC-MS 分析中质谱条件的选择。2.2 主要实验材料与仪器盐酸左氧氟沙星胶囊（0.1g 或 0.2g） ，左氧氟沙星（levofloxacin）和环丙沙星（ ciprofloxacin）对照品，色谱纯甲醇、甲酸，分析纯醋酸铵；液相色谱-质谱联用仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，不同规格移液枪（5，20，50，100，200，1000L ）和容量瓶（10，25mL) ，10m1 具塞离心管若干。2.3 实验原理以环丙沙星为内标，建立尿中左氧氟沙星的 LC-MSMS 测定方法，着重考察方法的专属性和基质效应，选择最佳色
11、-质条件。质谱测定方法采用多反应离子监测(MRM) 方式。2.4 实验方法1色谱和质谱条件：色谱柱为 C18 柱(100mm2.1mm ，3.5m) ；甲醇-1mmolL 醋酸铵溶液-甲酸(35：65：0.01)为流动相，流速0.25mLmin；进样量 10L。电喷雾(ESI)离子源，正离子电离模式，多反应离子监测(MRM) 的 MS 扫描方式，左氧氟沙星和内标环丙沙星的检测离子对划分别为 362.2318.2 和 332.2288.20（mz） ；MS 参数：毛细管电压 5.5kV，加热温度 400。2标准溶液配制：取约 5mg 左氧氟沙星对照品，精密称定，置 25mL 量瓶中，用甲醇溶解并
12、定容，精密吸取适量，用甲醇分别稀释成 5、10、25、50、100、150、250 和 500gmL 的标准系列溶液，置 4冰箱保存。取 5mg 环丙沙星，精密称定，置 25mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容。取适量用甲醇稀释成 200gmL ，即得内标溶液，置 4冰箱保存。3.尿样处理：取 1mL 人尿液样品，加入 10L内标溶液，再加入 2mL 水( 根据实测浓度调整稀释倍数，同时考察调整后的基质效应)，混匀，用 0.45m孔径的偏氟膜过滤，取 10L滤液进样分析。4专属性考察：取人空白尿样、添加左氧氟沙星和内标的空白尿样、健康受试者口服盐酸左氧氟沙星胶囊后的尿样(加内标) ，按“尿样处理”项
13、下自“再加入 2mL 水”起，依法处理后，在选定的条件下进样分析，比较三者图谱，考察方法专属性。必要时对色谱、质谱条件作适当调整。5基质效应的评价：取人空白尿液 1.0mL，加入 2.0mL 水，混匀，用 0.45m孔径的偏氟膜过滤得滤液。在滤液中分别加入不同浓度的左氧氟沙星标准溶液，使其终浓度分别为 0.5，1.5 和 4gmL每浓度点平行 3 份。另用纯水代替空白尿液，同法操作。将上述溶液分别进样测定，获得相应的峰面积。以同浓度下两种不同处理方法的样品峰面积(A 尿 A 水 )的比值来评价基质效应。6标准曲线制备：精密量取不同浓度的标准系列溶液 10L，置氮气流下挥干，精密加入人空白尿液
14、1.0mL，漩涡混合，制成浓度分别为 0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5 和 5gmL 的氧氟沙星尿液标准溶液，每浓度点平行 2 份。按“ 尿样处理” 项下方法处理后，进样分析，记录峰面积。以左氧氟沙星与内标峰面积的比值对左氧氟沙星尿样浓度进行线性回归，得回归方程。7尿液样品的测定：健康男性志愿者单剂量口服 0.10.2g 盐酸左氧氟沙星胶囊，在服药前和服药后不同时间段收集尿液，记录体积。按“尿样处理 ”项下方法处理后，进样分析，记录峰面积。将左氧氟沙星与内标的峰面积比值代入标准曲线，计算尿药浓度。2.5 注意事项1尿液主要成分是水、尿素、盐类，易长细菌，宜 4冷藏或加防腐
15、剂。2.左氧氟沙星主要以原型自肾排泄，在体内代谢甚少。口服 48h内尿中排出量约为给药量的 80%90%。尿中浓度随给药量变化而变化，尿中达峰时间约为 2h，可先进行预试，根据尿中实际浓度，调整尿液稀释倍数。3.不同型号的 LC-MS 仪、色谱柱，测定条件可能有较大差异，需要进行优化。2.6 参考文献施爱明,潘杰,张全英,等. LC-MSMS 法测定人血浆中左氧氟沙星浓度.药学进展，2008,32(5):228.3 GC-MS 法测定大鼠肝脏组织中盐酸克伦特罗浓度3.1 目的要求1.掌握固相萃取法的原理和方法。2.熟悉组织样品的前处理方法。3.熟悉 GC-MS 质谱条件的选择。3.2 主要实验
16、器材与仪器盐酸克伦特罗（clenbuterol hydrochloride）样品和对照品，分析纯双甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA),甲醇、甲苯、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠等。GC-MS 联用仪、涡旋混合器、恒温干燥箱、高速冷冻离心机、组织匀浆机、阳离子交换萃取小柱。SD 大鼠（180220g ） 。3.3 实验原理利用盐酸克伦特罗的碱性，采用碳酸钠碱性条件下使盐酸克伦特罗游离，用有机溶剂乙酸乙酯萃取。然后在有机相中加入稀盐酸酸化，使克伦特罗离子化而溶于酸水中，进一步采用阳离子交换固相小柱去除杂质。再与 BSTFA 衍生化，用 GC-MS 进行检测。3.4 实验方法1.色谱和质谱条件：GC
17、 色谱柱为 HP-5MS 毛细管柱（30m0.25mm0.25m） ；程序升温：初始柱温 70（保持 1min） ，以 20min 升至 180（保持 1min） ，以 5min 升至 220（保持2min） ，以 25min 升至 260（保持 2min） ；进样口温度 280；不分流进样，进样量 1.0L；载气高纯 He： 1.0mLmin。EI 源，源温度 200；传输线温度 280；电离电压为 70eV；四级杆温度 160；测定方式为全扫描和选择离子检测，条件如下：03.5min 为溶剂延迟时间，3.515.0min，全扫描范围（mz 50400） ，监测离子（mz 86） ，15.0
18、min最后，关闭灯丝。2.标准溶液的配制：精密称取 10mg 盐酸克伦特罗于 100mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，得盐酸克伦特罗标准储备液。然后用甲醇配制 0.5、1、5、15、50 和 200gmL 浓度系列的标准溶液。3.组织样品的处理（1）稀酸提取：取大鼠肝脏约 1g，精密称定，加水 5mL，匀浆，在匀浆液中加入 20mL 乙酸乙酯（定量转移至 50 mL 离心管中） ，再加入 15%碳酸钠溶液 2 mL，超声 15min 后，于高速冷冻离心机上以 6000r min 离心 5min，收集上层有机相，再加入 10 mL 乙酸乙酯于离心管中，超声提取 15min 后，收集合并有机相。在收
19、集的有机相中加入 0.2molL 的稀盐酸溶液 2mL，旋涡混合后，于5000rmin 离心 5min，吸取下层水相，重复萃取一次，合并两次萃取的水相，用稀 NaOH 溶液调节 pH 至 5.5。（2）阳离子交换萃取小柱净化：将阳离子交换小柱依次经过5mL 甲醇、5mL 水和 5mL 20mmolL 稀盐酸活化，然后将处理好的稀酸提取液上样至小柱，依次用 5mL 水和 5mL 甲醇淋洗柱子，抽干小柱，再用 5mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液 5mL 的刻度试管中。（3）衍生化：洗脱液与 50水浴氮气流下吹干，精密加入200L的甲苯和 100L的 BSTFA，充分旋涡混合 30s，在 80的烘
20、箱中加热衍生 1h（反应容器加盖盖紧）。衍生完毕待冷却后转移入进样品中，进行 GC-MS 检测。4.标准曲线的制备：分别取大鼠空白肝脏 1g，加水 5mL，匀浆，在匀浆液中分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液 10L，使匀浆液中终浓度分别为 5，10，50，150，500 和 2000ng/g 组织，混匀。照“ 组织样品处理 ”项下自 “在匀浆中加入 20mL 乙酸乙酯”起，依法进行稀酸提取、阳离子交换萃取小柱净化和衍生化处理，GC-MS 测定。以盐酸克伦特罗浓度对相应的峰面积进行线性回归，获得标准曲线。5.样品测定：取盐酸克伦特罗样品，按 50g/kg给药剂量灌胃给予 SD 大鼠。在给药后
21、 1h，处死大鼠。肝脏以生理盐水灌流，并用滤纸吸干水分。精密称取肝组织 1g，按“组织样品处理” 项下方法进行测定。将获得的峰面积代入标准曲线，计算肝组织中盐酸克伦特罗的浓度。3.5 注意事项固相萃取小柱使用前需要进行活化，一般先用甲醇，再用水冲洗。对于阳离子或阴离子交换小柱还需用酸或碱进一步活化。3.6 参考文献1 王红 .气相色谱- 质谱法检测动物肝脏组织中盐酸克伦特罗.中国卫生检验杂志，2007,17(8):1409.2 吴银良 ,李晓薇,杨挺,等. 气相色谱- 质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺.分析化学，2006,34(8):1083. 4.原子吸收分光光度法测定头发中
22、锌含量4.1 目的要求1.掌握消化法处理生物样品的方法。2.熟悉原子吸收分光光度法检测原理和方法。4.2 主要实验材料与仪器色谱纯锌，优质纯硝酸，分析纯盐酸、高氯酸、氨水。原子吸收分光光度计、锌空心阴极灯、电热板4.3 实验原理采用硝酸-高氯酸对头发进行消解处理，使微量锌以金属离子状态转入溶液溶液，用原子吸收分光光度法测定。样品溶液进入火焰后，待测元素的基态原子吸收来自同种元素空心阴极灯发射的共振线，其吸收强度在一定范围内与待测元素浓度成正比，采用标准曲线法进行定量。4.4 实验方法1.仪器参数：检测波长 213.9nm；光谱通带 0.40.8nm；灯电流34mA；空气流量 56L/min；乙
23、炔流量 1L/min；火焰高度612mm。2.锌标准溶液的制备：取金属锌 1g，精密称定，置 200mL 烧杯中，加入 6mol/L 盐酸溶液 3040mL，使锌溶液，待溶解完全后，加热煮沸数分钟，冷却，定量转移至 1000mL 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为 1mg/mL 的锌标准储备液；精密移取10mL 锌储备液于 100mL 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为 100g/mL 的锌标准溶液；精密移取 10mL 锌标准溶液于100mL 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为 10g/mL的锌标准溶液。3.样品处理（1）发样洗涤：取头发 0.3g 左右，用剪刀剪
24、成 12cm 的小段，置 50mL 烧杯中，用 5%氨水（pH 置 8.08.5）浸泡 30min，用自来水漂洗 34 次，再用二次去离子水冲洗 45 次，置于 65烘箱中干燥 4h，取出后放入干燥器中保存备用。（2）消化处理：取经过洗涤处理的头发 0.2g，精密称定，置于100mL 烧杯中，加入 5mL 浓硝酸，盖上表面皿，在电热板上加热消解，待完全溶解后取下，冷却至室温，加入高氯酸 1mL，再在电热板上继续加热，冒白烟至溶液剩余 12mL 时（切不可蒸干）取下，冷却后加入适量蒸馏水，定量转移至 100mL 量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀待测。同时按相同步骤制备 1 份空白溶液。4标准曲线的
25、制备：精密吸取浓度为 10g/mL 的锌标准溶液0，2，4，6，8，10mL ，分别置于 6 个 100mL 量瓶中，用 1%高氯酸溶液稀释至刻度，摇匀。于 213.9nm 波长下测定吸光度值，以浓度对吸光度值做线性回归，获得标准曲线。5样品测定：取头发适量（3 份） ，按“样品处理” 项下方法操作，照标准曲线测定条件测定样品溶液的吸光度，将测得的吸光度值代入标准曲线，计算供试液中锌浓度，并根据头发取样量求得发样中锌含量（g/g ） 。4.5 注意事项1. 本实验采用硝酸-高氯酸消解法对头发进行处理，这是湿法有机破坏的常用消解液，其破坏力强，适用于生物样品的破坏，所得无机金属离子为高价态。由于
26、硝酸和高氯酸均具有氧化性，破坏反应激烈，切勿将溶液蒸干，以免爆炸。消化操作应在通风柜内进行。2乙炔（燃气）-空气（助燃气）流量比对锌测定有较大影响，应通过实验选择。此外，光谱通带、灯电流、火焰高度等均对测定有一定影响，需要进行选择。4.6 参考文献1 黄高明，孙林超.人体头发中锌含量分析研究.农产品加工学刊，2007,11:87.2 马威，袁英贤.原子吸收法测头发中锌含量的方法探讨.河南科学，2003,21(6):722.3 张桂文.原子吸收光谱法测定儿童头发中锌含量.辽宁化工，2009,38(10):770.5 双氯芬酸钠的生物利用度5.1 目的要求1.掌握药物生物利用度测定的实验设计和数据
27、处理方法。2.掌握大鼠眼眶采血技术和常用给药技术。5.2 主要实验材料与仪器双氯芬酸钠（diclofenac sodium）,布洛芬（ibuprofen ） ，肝素，色谱纯甲醇，分析纯 KH2PO4；13000rmin 离心机，高效液相色谱仪；SD 雄性大鼠（ 180220g） 。5.3 实验原理用甲醇沉淀血浆蛋白，以布洛芬为内标，HPLC 法测定大鼠血浆中双氯芬酸钠浓度。根据静脉注射给药和灌胃给药的药动学参数（AUC ）和给药剂量(D) 计算双氯芬酸钠的生物利用度。5.4 实验方法1.色谱条件：分析柱为 C18（250mm4.6mm，5m） ；流动相为甲醇-20mmolL KH2PO4 溶液
28、（pH 3） （50：50） ；检测波长282nm；进样量 20L。2.标准曲线的制备：取双氯芬酸钠适量，用甲醇配制出浓度为1mgmL 的储备液，然后用甲醇稀释至 200，100，50，10，5，2和 1gmL 的溶液作为标准溶液。取布洛芬适量，用甲醇溶解并稀释制成浓度为 20gmL 的溶液，作为内标溶液。取空白大鼠血浆 100L，分别加入上述双氯芬酸钠标准溶液10L和布洛芬溶液 10L，混匀，再加入 250L甲醇溶液，混匀，在 10000rmin 下离心 10min，取上清液 20L进样测定。将双氯芬酸钠的峰面积与内标峰面积的比值与双氯芬酸钠浓度进行线性回归，获得标准曲线。3.血样采集：取
29、SD 雄性大鼠 12 只，随机分成 2 组，将其中一组按 20mgkg 的给药剂量灌胃给药，另一组按 2mgkg 的给药剂量尾静脉注射给药。分别在给药前和给药后5，10，15，30，45，60，90，120，240，360 和 480min，眼眶取血250L，置于肝素离心管中，5000rmin 离心，取 100L血浆，4放置备用。4.样品分析：取大鼠血浆样品 100L，加入内标溶液 10L，加入甲醇 260L，混匀，在 10000rmin 离心 10min，取上清液 20L进样。将双氯芬酸钠与内标的峰面积比值代入标准曲线中，计算相应的浓度。5.数据分析：灌胃给药和静脉注射给药各大鼠不同时间点的
30、血药浓度按表 1 和表 2 填写。采用药动学分析软件 DAS2.0 计算药物动力学参数。并按以下公式计算生物利用度：生物利用度 F= 100%AUCivpoD5.5 注意事项1.计算药物动力学参数的软件有很多，如 3P97，DAS2.0 等。可根据实验室已有的软件进行计算。开始计算前，需保证时间和浓度的单位一致。在进行计算时，有两种拟合模型，分别是房室模型和统计钜模型。当采用房室模型拟合时，可能出现同一组动物数据中出现不同房室模型的情况，使数据处理出现偏差。因此，常用的拟合模型为统计矩模型。2.静脉注射组开始几个时间点的样品浓度有可能超出标准范围的上限，出现这种情况时，应将样品用空白大鼠血浆稀
31、释后测定。表 1 灌胃给药各大鼠不同时间点的血药浓度（ g/mL）时间 鼠 号（min） 1 2 3 4 5 65101530表 2 静脉注射给药大鼠不同时间点的血药浓度（ g/mL）时间 鼠 号（min） 1 2 3 4 5 651015305.6 参考文献1Len-Reyes MR,Castaneda-Hernndez G, Ortize MI. Pharmacokinetic of declofenac in the presence and absence of glibenclamide in the rat. J Pharm Pharmaceut Sci 2009,12(3):28
32、0.2 Musmade P, Subramanian G, Srinivasan KK, High-performance liquid chromatography and pharmacokinethcs of aceclofenac in rats. Analytical Chmica Acta.2007, 585:103.6血浆蛋白结合率测定6.1 目的要求1.掌握超滤法测定蛋白结合率的方法。2.熟悉实验条件的考察与选择。6.2 主要实验材料与仪器龙胆苦苷（gentiopicroside，GPS） ，正常人血浆，色谱纯甲醇，分析纯磷酸盐；超滤管（10k） ，可控温高速离心机，Eppen
33、dor（EP）离心管，高效液相色谱仪；昆明种小鼠。6.3 实验原理将龙胆苦苷与人血浆混合，平衡一段时间，取其中一部分通过超滤管，分别测定血浆中龙胆苦苷总浓度和超滤管中龙胆苦苷游离浓度，计算血浆蛋白结合率。6.4 实验方法1.色谱条件：C 18 柱；流动相为甲醇-水（28:72） ，流速1mL/min；检测波长 274nm；进样量 20L。2.标准曲线的制备：取干燥至恒重的 GPS 对照品约 25mg，精密称定，置 25mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为1mg/mL 的对照品储备液。精密吸取储备液 1mL 于 10mL 量瓶中，加 pH7.4 的磷酸盐缓冲液至刻度。再精密量取0.0
34、5，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0mL 于 25mL 量瓶中，加 pH7.4 的磷酸盐缓冲液至 6mL，加甲醇至刻度，得浓度为0.2，0.4，0.8，2，4，8g/mL 的系列标准溶液，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液进样测定，以峰面积对浓度进行回归，得标准曲线方程。3.超滤管吸附性试验：取 GPS 标准储备液（ 1mg/mL）适量，用pH7.4 的磷酸盐缓冲液稀释至刻度为 1，5 和 10g/mL 的溶液，分别取 500L置超滤管中，于 4000r/min 下离心 25min（离心机温度设为37） 。分别取超滤管和未离心溶液 100L，各加入 300L甲醇，旋涡混合 30s，16000r
35、/min 离心 15min，取上清液过微孔滤膜，取20L续滤液进行 HPLC 分析。计算超滤管吸附性。如果超滤管对药物吸附过多，应对超滤管进行测定溶液饱和处理。方法如下：取上述吸附性试验项下低、中、高 3 种浓度溶液各1mL，置超滤管中饱和 24h，弃去溶液，用滤纸将超滤管中残液吸干，然后再进行吸附试验。4. 血浆蛋白结合率试验：分别精密吸取 1mg/mL 的 GPS 对照品储备液 0.5，2.5，5.0mL 于 25mL 量瓶中，加 pH7.4 的磷酸盐缓冲液至刻度，得到浓度为 20，100 和 200g/mL 的 GPS 溶液。分别精密吸取 3 种浓度的 GPS 溶液 50L于 EP 管中
36、，加入人血浆 950L，漩涡混合均匀，置于 37水浴平衡 4h，移取 500L，置超滤管中（若有必要对超滤管进行饱和处理） ，于 4000r/min 离心 25min（离心机温度设为 37） ，取超滤液 100L，照“血浆中龙胆苦苷总浓度测定”方法操作，将测得的峰面积代入标准曲线，求得超滤液中 GPS 浓度。同时测定血浆中龙胆苦苷总浓度。5. 血浆中龙胆苦苷总浓度测定：精确吸取 100L血浆，加入300L甲醇，旋涡混合 30s，16000r/min 离心 15min，取上清液过微孔滤膜，取 20L续滤液进样分析。6. 血浆蛋白结合率计算：根据超滤液中 GPS 浓度（ 1）和血浆中 GPS 总浓
37、度（ 2） ，按下列公式计算龙胆苦苷血浆蛋白结合率：血浆蛋白结合率 %=（ 1-2 2）100%6.5 注意事项1. 超滤法是利用半透膜原理对游离药物和结合药物进行分离，设备简单、操作方便，其最大优点是实现血浆中游离药物的快速分离，仅十几分钟至数十分钟即可收集到足够供测定的血浆超滤液。但此法也存在一定弊端：分离过程中结合平衡不稳定；对高蛋白结合率药物的游离浓度难以准确检测；结合药物在透过滤膜时会出现泄漏；超滤装置对药物具有吸附性。因此，实验前应先考察超滤管对龙胆苦苷的吸附性，必要时对结合反应的温度、pH 值等因素进行考察。2. 温度考察：血浆蛋白结合率试验温度一般为 4和 37，按“血浆蛋白结
38、合率试验” 项下方法配制 GPS 低、中、高 3 个浓度（1、5、10g/mL ）的样品溶液，分别置 37水浴和 4冰箱中，于0、1、2、3、4h 取样测定浓度，考察不同温度下 GPS 稳定性，选择血浆蛋白结合率试验的适合温度。3. 龙胆苦苷在 pH7.4 缓冲溶液中的稳定性考察：取龙胆苦苷标准储备液适量，用 pH7.4 的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 25g/mL的溶液，在室温下放置 2、4h，分别取 20L测定峰面积，与 0 时峰面积比较，考察龙胆苦苷在 pH7.4 溶液中的稳定性。 6.6 参考文献1 王长虹,王峥涛.超滤法测定龙胆苦苷的血浆蛋白结合率.中国药学杂志，2005,40(3):2
39、32.2 王立,任君刚.超滤法测定表没食子儿茶素没食子酸酯人血浆蛋白结合率，中国药学杂志，2008,43(20):1579.3 赵淑红,蒋袁絮,高亦珑,等.家兔血浆中龙胆苦苷浓度的高效液相色谱测定.时珍国医国药，2010,21(5):1131.7 木犀草素的离体肠吸收实验7.1 目的要求1.掌握离体肠吸收实验原理与计算方法。2.熟悉离体外翻肠囊法实验操作。7.2 主要实验器材与仪器Krebs-Ringer 缓冲液，木犀草素（luteolion）,色谱纯甲醇，分析纯磷酸；高效液相色谱仪，恒温水浴锅；SD 大鼠（180220g） 。7.3 实验原理采用离体外翻肠囊法，将一段（515cm ）大鼠小肠
40、外翻，使肠粘膜朝外，浆膜朝内，肠的一端结扎，另一端插入一套管后用线扎紧。通过套管往肠囊内充盈一定量 K 氏液，并将肠囊浸在一定体积的 K 氏液（含有一定浓度的木犀草素）中。通过套管于不同时间点吸取浆膜侧溶液进行测定，分析药物透过肠道情况。7.4 实验方法1.色谱条件:分析住为 C18 柱；流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液（50:50） ，流速为 1.0mLmin，检测波长为 350nm。2. Krebs-Ringer 缓冲液（ K 氏液）的配制：取 0.37gCaCl2 和0.22gMgCl2，加入适量的水超声使溶解，再依次加入 7.52g NaCl， 0.35g KCl，0.29g NaH2P
41、O42H2O， 1.37g NaHCO3 和 1.4g 葡萄糖，溶解混匀后，加入水定容至 1000mL。再用 1.0molL 的H3PO4 调节 pH 至 6.8，备用（临用新鲜配制） 。3.标准曲线的制备：取木犀素适量，精密称定，用甲醇配置成1mgmL 的溶液，4保存。取标准溶液适量，用 K 氏液稀释，制成含木犀草素 0.2，0.4，0.6，1.0，1.5，2.0 和 4.0gmL 的溶液。分别取 20L进样，测得峰面积。以木犀草素浓度对相应的峰面积进行线性回归，得标准曲线。4.肠段的选取和外翻肠囊的制备：选取健康 SD 大鼠，颈动脉放血处死，开腹腔暴露出小肠，在离幽门 15cm 处取空肠段
42、，去除肠系膜。用 37K 氏液洗净，剪取空肠前段 10cm，将一端结扎，用圆头玻璃棒小心的将肠段翻转，使肠粘膜层在外，浆膜层在内，放入K 氏液中洗净，用滤纸吸干粘膜表面液体。在肠囊内放入取样细软管后用线扎紧，通过取样细软管，用刻度注射器往肠囊内充盈定量的 K 氏液。5.样品的采集和测定：将准备好的肠囊放入定量（一般 50mL）装有 K 氏液（含 10gmL 木犀草素）的锥形瓶中，往瓶中通入含5%CO2 的氧气，并置于 37的水浴锅中保温。于不同的时间点（0，0.25，0.5，1，1.5，2h） ，通过采样细软管采集 0.2mL 肠囊内液体，并同时快速补充等量新鲜 K 氏液。取样完毕后精确测定肠
43、囊的表面积。采用建立的 HPLC 法测定样品中木犀草素峰面积，并代入标准曲线计算相应的浓度。6.结果计算：计算单位表面积木犀草素的累积吸收量（ngcm 2） ，并以累积吸收量-时间作曲线。以肠囊内 t 时间点浓度的对数与时间进行回归，得方程 LnC=A+Kat，可以求得目标成分在大鼠肠囊的吸收速度常数（K a） 。并计算表观渗透系数（ apparent permeability coefficients, Papp） 。Papp= t2)(0CAVend7.5 注意事项1.离体肠吸收属于急性离体实验，清洗步骤中在去除肠内容物的同时很可能降低了肠内多种酶系的活力，外翻的过程也可能对肠管的组织结构
44、有一定的影响，因此操作必须在冰浴中进行，尽可能避免肠段的机械性损伤。2.离体肠吸收法作为一种离体药物吸收的模型，在有机培养液，如 K 氏液中，能使小肠在 60min 内保持较强的活性，2h 后离体肠段失活，因此实验必须在 2h 内完成。3.一般药物在 K 氏液中溶解度较差，因此可以使用 DMSO 等增溶剂，但增溶剂含量必须小于 3.0，否则会使肠段加速失活。4.往含药的 K 氏液锥形瓶中通入含 5%CO2 的氧气时，必须先经过缓冲装置，否则气流大小难以控制，容易造成液体外溅。5.采集样品后往肠囊内补充的等量新鲜的 K 氏液的温度必须是37，并避免气体注入肠囊。采集肠囊内药液时，内部软细管口应离
45、开肠壁，避免损伤或戳破肠壁。8.地西泮的体外代谢试验8.1 目的要求1.掌握药物体外代谢实验原理和酶动力学参数的计算方法。2.熟悉体外代谢反应实验条件的选择。8.2 主要实验材料与仪器地西泮（diazepam, M=284.74）,N-去甲地西泮（nordiazepam, M=270.74）,氯硝西泮（ clonazepam， M=315.72） ，鼠肝微粒体，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH， M=833.35） ，Tris-HCl缓冲液，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪。8.3 实验原理地西泮与鼠肝微粒体重药酶作用，产生中间活性代谢物 N-去甲地西泮。孵育反应完成后用乙酸乙酯提取两者，
46、以氯硝西泮为内标，采用 HPLC 法测定地西泮和 N-去甲地西泮的含量。根据底物剩余量或产物生成量计算酶动力学参数。8.4 实验方法1.色谱条件：分析柱为 C18 柱（150mm4.6mm，5m） ；流动相为乙腈-0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH3） （60:40） ，流速 1mL/min；检测波长 254nm。2.溶液配制（1）NADPH 溶液配制：取 NADPH 3.3mg，用 1%NaHCO3 溶液稀释成 200L，制成 20mmol/L 的 NADPH 溶液，4放置备用（宜临用新配） 。（2）Tris-HCl 溶液配制：取 Tris-HCl 和 MgCl2 适量，加蒸馏水适量使溶
47、液，用 HCl 调节 pH 值至 7.4，再用蒸馏水稀释至 Tris-HCl和 MgCl2 的浓度分别为 0.1 和 0.015mol/L 的溶液，4保存备用。（3）样品溶液配制：取地西泮和 N-去甲地西泮适量，精密称定，分别用 DMSO 溶解并稀释制成地西泮浓度为 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500mmol/L 的溶液， N-去甲地西泮浓度为 1, 5, 10, 20, 50, 100 mmol/L 的溶液。另取氯硝西泮适量，精密称定，用 DMSO 稀释至浓度为 1mmol/L 的溶液，作为内标溶液。以上溶液均于 4放置备用。3.样品处理：取 100L孵育后微粒体溶
48、液，加入 10L内标溶液，混匀，在沸水浴中放置 30s，再加入 1.0mL 乙酸乙酯溶液，涡旋提取 2min，在 5000r/min 离心 5min，将上层有机层转移至另一 Ep 离心管中，至氮气流下挥干，残留物用 100L流动相溶解，10000r/min 离心 10min，取上清液 20L进样测定。4.标准曲线制备：取空白失活微粒体适量，用 Tris-HCl 溶液稀释到 1000L，使微粒体蛋白浓度为 1mg/mL，分别加入上述不同浓度的地西泮和 N-去甲地西泮 1L，使地西泮和 N-去甲地西泮的浓度分别为 10，20，50，100，200，300，500mol/L 和1，5，10，20，5
49、0，100mol/L，混匀，按 “样品处理”项下方法操作。将样品峰面积与内标峰面积比值与相应的样品浓度进行线性回归，获得标准曲线。5.酶动力学参数测定：取微粒体适量，用 Tris-HCl 溶液稀释到1000L，使微粒体蛋白浓度为 1mg/mL，分别加入 1L不同浓度的地西泮溶液，使其终浓度分别为10，20，50，100，200，300，500mol/L，混匀，每浓度点平行 3份。37预孵育 5min，分别加入 NADPH 溶液 10L启动反应，反应 30min 后，在沸水浴中放置 30s 终止反应，按“ 样品处理”项下方法操作。分别计算地西泮的剩余浓度以及 N-去甲地西泮的生成浓度。利用非线性回归方程（Lineweaver Burk
