1、内科学风湿病专业优秀论文 60kD SSA/Ro 抗原不同表位 ScFv 抗体对相关自身免疫病致病机制的研究关键词：自身免疫病 SSA 抗原 抗原表位 单链抗体 重组融合蛋白 分子克隆 基因表达 致病机制摘要：研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等
2、相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20 个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60
3、抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗lt;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿假单胞菌外毒素 A(Pseudomonasaeruginosa exotoxin A，PE)中的 PE40 片断重组融合为
4、免疫毒素 ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨 Ro60 抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损害的潜能。 研究目的 1获取 R060 抗原 3 个不同表位的 ScFv 单抗与毒素 PE40 的重组融合蛋白(免疫毒素 EPlP、EP2P 和EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗 P1、P2、P3 及毒素蛋白 PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2Ro60 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c 鼠的重要脏器损害。 3正常 BABL/c 鼠体内，抗 R060 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否
5、导致各自特异的组织细胞损害。 方法 1用 PCR方法扩增：R060 抗原 3 个表位的 ScFv 单抗序列、PE40 序列，并将扩增的 3 个ScFv 分别与 PE40 连接(ScFv-PE40)，将 3 个 ScFv-PE40、3 个 ScFv、1 个 PE40片断分别插入载体 pET32a(+)，获得 7 个表达克隆，DNA 测序确定插入序列及插入载体的位点是否正确。 2 IPTG 诱导 7 个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂 IPTG 的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。 3用 NTA-Ni 亲和层析柱纯化 7 种可溶性表
6、达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中 4 种蛋白(3 个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、EPE40。 4使用 ELISA 方法鉴定 6 个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P 和 EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转染试剂将 4 个重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EAhy 926)，MTT 法测定 4 种蛋白的细胞毒活性。 548 只正常 BALB/c 鼠随机平均分为 8 组，分别间隙尾静脉注射 7 种经鉴定的重组蛋白和 PBS 共 2 周，眼
7、静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规 HE 染色后病理检查，并分析检查结果。 结果 1获得 7 种重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EPE40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3 分别特异性识别 R060 抗原表位482493、310323、230241，重组蛋白 EP1P、EP2P、EP3P 和 EPE40 均具有明显的细胞毒活性。 2动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片 HE 染色检查结果正常，但 EP1P 处理组小鼠较其他实验组出现明显的肺脏出血。 结论 1成功获得 R
8、060 抗原 3 个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P 和 EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3 单抗及 PE40 毒素蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合能力和/或细胞毒活性。 2初步动物实验的结果显示：所研究的 3 个 R060 抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分 R060 表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同 Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3实验获得的 3 个 Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研
9、究提供了工具和参考手段。正文内容研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，
10、不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20 个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60 抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗l
11、t;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿假单胞菌外毒素 A(Pseudomonasaeruginosa exotoxin A，PE)中的 PE40 片断重组融合为免疫毒素 ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨 Ro60 抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损
12、害的潜能。 研究目的 1获取 R060 抗原 3 个不同表位的 ScFv 单抗与毒素 PE40 的重组融合蛋白(免疫毒素 EPlP、EP2P 和EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗 P1、P2、P3 及毒素蛋白 PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2Ro60 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c 鼠的重要脏器损害。 3正常 BABL/c 鼠体内，抗 R060 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致各自特异的组织细胞损害。 方法 1用 PCR方法扩增：R060 抗原 3 个表位的 ScFv 单抗序列、PE40 序列，并将扩增的 3 个ScFv 分别与 PE40 连接(S
13、cFv-PE40)，将 3 个 ScFv-PE40、3 个 ScFv、1 个 PE40片断分别插入载体 pET32a(+)，获得 7 个表达克隆，DNA 测序确定插入序列及插入载体的位点是否正确。 2 IPTG 诱导 7 个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂 IPTG 的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。 3用 NTA-Ni 亲和层析柱纯化 7 种可溶性表达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中 4 种蛋白(3 个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、
14、EPE40。 4使用 ELISA 方法鉴定 6 个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P 和 EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转染试剂将 4 个重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EAhy 926)，MTT 法测定 4 种蛋白的细胞毒活性。 548 只正常 BALB/c 鼠随机平均分为 8 组，分别间隙尾静脉注射 7 种经鉴定的重组蛋白和 PBS 共 2 周，眼静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规 HE 染色后病理检查，并分析检查结果。 结果 1获得 7 种重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EP
15、E40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3 分别特异性识别 R060 抗原表位482493、310323、230241，重组蛋白 EP1P、EP2P、EP3P 和 EPE40 均具有明显的细胞毒活性。 2动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片 HE 染色检查结果正常，但 EP1P 处理组小鼠较其他实验组出现明显的肺脏出血。 结论 1成功获得 R060 抗原 3 个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P 和 EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3 单抗及 PE40 毒素蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合
16、能力和/或细胞毒活性。 2初步动物实验的结果显示：所研究的 3 个 R060 抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分 R060 表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同 Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3实验获得的 3 个 Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研究提供了工具和参考手段。研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在
17、于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20 个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留
18、其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60 抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗lt;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物
19、。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿假单胞菌外毒素 A(Pseudomonasaeruginosa exotoxin A，PE)中的 PE40 片断重组融合为免疫毒素 ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨 Ro60 抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损害的潜能。 研究目的 1获取 R060 抗原 3 个不同表位的 ScFv 单抗与毒素 PE40 的重组融合蛋白(免疫毒素 EPlP、EP2P 和EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗 P1
20、、P2、P3 及毒素蛋白 PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2Ro60 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c 鼠的重要脏器损害。 3正常 BABL/c 鼠体内，抗 R060 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致各自特异的组织细胞损害。 方法 1用 PCR方法扩增：R060 抗原 3 个表位的 ScFv 单抗序列、PE40 序列，并将扩增的 3 个ScFv 分别与 PE40 连接(ScFv-PE40)，将 3 个 ScFv-PE40、3 个 ScFv、1 个 PE40片断分别插入载体 pET32a(+)，获得 7 个表达克隆，DNA 测序确定插入序列及插入载体的位点
21、是否正确。 2 IPTG 诱导 7 个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂 IPTG 的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。 3用 NTA-Ni 亲和层析柱纯化 7 种可溶性表达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中 4 种蛋白(3 个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、EPE40。 4使用 ELISA 方法鉴定 6 个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P 和 EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转染试剂将 4 个重组蛋白(EP1P、EP2
22、P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EAhy 926)，MTT 法测定 4 种蛋白的细胞毒活性。 548 只正常 BALB/c 鼠随机平均分为 8 组，分别间隙尾静脉注射 7 种经鉴定的重组蛋白和 PBS 共 2 周，眼静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规 HE 染色后病理检查，并分析检查结果。 结果 1获得 7 种重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EPE40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3 分别特异性识别 R060 抗原表位482493、310323、230241，重组蛋白 EP1P、EP
23、2P、EP3P 和 EPE40 均具有明显的细胞毒活性。 2动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片 HE 染色检查结果正常，但 EP1P 处理组小鼠较其他实验组出现明显的肺脏出血。 结论 1成功获得 R060 抗原 3 个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P 和 EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3 单抗及 PE40 毒素蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合能力和/或细胞毒活性。 2初步动物实验的结果显示：所研究的 3 个 R060 抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分 R060 表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可
24、以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同 Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3实验获得的 3 个 Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研究提供了工具和参考手段。研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹
25、、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20 个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，
26、根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60 抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗lt;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿假单胞菌外毒素 A(Pseudomonasaeruginosa exot
27、oxin A，PE)中的 PE40 片断重组融合为免疫毒素 ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨 Ro60 抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损害的潜能。 研究目的 1获取 R060 抗原 3 个不同表位的 ScFv 单抗与毒素 PE40 的重组融合蛋白(免疫毒素 EPlP、EP2P 和EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗 P1、P2、P3 及毒素蛋白 PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2Ro60 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c 鼠的重要脏器损害。 3正常 BABL/c 鼠体内，
28、抗 R060 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致各自特异的组织细胞损害。 方法 1用 PCR方法扩增：R060 抗原 3 个表位的 ScFv 单抗序列、PE40 序列，并将扩增的 3 个ScFv 分别与 PE40 连接(ScFv-PE40)，将 3 个 ScFv-PE40、3 个 ScFv、1 个 PE40片断分别插入载体 pET32a(+)，获得 7 个表达克隆，DNA 测序确定插入序列及插入载体的位点是否正确。 2 IPTG 诱导 7 个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂 IPTG 的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。
29、3用 NTA-Ni 亲和层析柱纯化 7 种可溶性表达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中 4 种蛋白(3 个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、EPE40。 4使用 ELISA 方法鉴定 6 个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P 和 EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转染试剂将 4 个重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EAhy 926)，MTT 法测定 4 种蛋白的细胞毒活性。 548 只正常 BALB/c 鼠随机平均分为 8 组，分别间隙尾静脉注射
30、 7 种经鉴定的重组蛋白和 PBS 共 2 周，眼静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规 HE 染色后病理检查，并分析检查结果。 结果 1获得 7 种重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EPE40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3 分别特异性识别 R060 抗原表位482493、310323、230241，重组蛋白 EP1P、EP2P、EP3P 和 EPE40 均具有明显的细胞毒活性。 2动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片 HE 染色检查结果正常，但 EP1P 处理组小鼠较其
31、他实验组出现明显的肺脏出血。 结论 1成功获得 R060 抗原 3 个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P 和 EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3 单抗及 PE40 毒素蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合能力和/或细胞毒活性。 2初步动物实验的结果显示：所研究的 3 个 R060 抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分 R060 表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同 Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3实验获得的 3 个 Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方
32、法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研究提供了工具和参考手段。研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表
33、位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20 个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60 抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体
34、抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗lt;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿假单胞菌外毒素 A(Pseudomonasaeruginosa exotoxin A，PE)中的 PE40 片断重组融合为免疫毒素 ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨 Ro60
35、 抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损害的潜能。 研究目的 1获取 R060 抗原 3 个不同表位的 ScFv 单抗与毒素 PE40 的重组融合蛋白(免疫毒素 EPlP、EP2P 和EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗 P1、P2、P3 及毒素蛋白 PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2Ro60 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c 鼠的重要脏器损害。 3正常 BABL/c 鼠体内，抗 R060 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致各自特异的组织细胞损害。 方法 1用 PCR方法扩增：R060 抗原 3 个表位的 ScFv 单抗序列、PE40 序列，并将扩增的
36、3 个ScFv 分别与 PE40 连接(ScFv-PE40)，将 3 个 ScFv-PE40、3 个 ScFv、1 个 PE40片断分别插入载体 pET32a(+)，获得 7 个表达克隆，DNA 测序确定插入序列及插入载体的位点是否正确。 2 IPTG 诱导 7 个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂 IPTG 的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。 3用 NTA-Ni 亲和层析柱纯化 7 种可溶性表达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中 4 种蛋白(3 个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相
37、应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、EPE40。 4使用 ELISA 方法鉴定 6 个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P 和 EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转染试剂将 4 个重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EAhy 926)，MTT 法测定 4 种蛋白的细胞毒活性。 548 只正常 BALB/c 鼠随机平均分为 8 组，分别间隙尾静脉注射 7 种经鉴定的重组蛋白和 PBS 共 2 周，眼静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规 HE 染色后病理检查，并分析检查结果。 结果 1获得 7 种重
38、组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EPE40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3 分别特异性识别 R060 抗原表位482493、310323、230241，重组蛋白 EP1P、EP2P、EP3P 和 EPE40 均具有明显的细胞毒活性。 2动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片 HE 染色检查结果正常，但 EP1P 处理组小鼠较其他实验组出现明显的肺脏出血。 结论 1成功获得 R060 抗原 3 个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P 和 EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3 单抗及 PE40 毒素
39、蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合能力和/或细胞毒活性。 2初步动物实验的结果显示：所研究的 3 个 R060 抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分 R060 表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同 Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3实验获得的 3 个 Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研究提供了工具和参考手段。研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织
40、细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SSc)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20
41、个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60 抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗lt;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分
42、别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿假单胞菌外毒素 A(Pseudomonasaeruginosa exotoxin A，PE)中的 PE40 片断重组融合为免疫毒素 ScFv-PE40，该免疫毒素兼有类似天然抗体的特异性抗原结合能力和对组织细胞定点损害功能。以此作用于实验动物，探讨 Ro60 抗原不同表位的自身抗体是否具有导致不同损害的潜能。 研究目的 1获取 R060 抗原 3 个不同表位的 ScFv 单抗与毒素 PE40 的重组融合蛋白(免疫毒素 EPlP、EP2P 和
43、EP3P)、实验对照用重组蛋白(单抗 P1、P2、P3 及毒素蛋白 PE40)，并鉴定它们应有的生物活性。 2Ro60 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致正常BABL/c 鼠的重要脏器损害。 3正常 BABL/c 鼠体内，抗 R060 抗原 3 个不同表位的自身抗体，能否导致各自特异的组织细胞损害。 方法 1用 PCR方法扩增：R060 抗原 3 个表位的 ScFv 单抗序列、PE40 序列，并将扩增的 3 个ScFv 分别与 PE40 连接(ScFv-PE40)，将 3 个 ScFv-PE40、3 个 ScFv、1 个 PE40片断分别插入载体 pET32a(+)，获得 7 个表达克隆
44、，DNA 测序确定插入序列及插入载体的位点是否正确。 2 IPTG 诱导 7 个克隆分别在大肠杆菌内表达，通过改变诱导剂 IPTG 的浓度、表达温度和表达时间，探索每种重组蛋白可溶性表达的最佳条件，并在此条件下诱导其大量表达。 3用 NTA-Ni 亲和层析柱纯化 7 种可溶性表达的载体融合蛋白，并用肠激酶切除其中 4 种蛋白(3 个ScFv-PE40、PE40)中的载体标签蛋白，从酶切体系中纯化不含标签蛋白的相应重组蛋白：EPlP、EP2P、EP3P、EPE40。 4使用 ELISA 方法鉴定 6 个重组蛋白(P1、P2、P3、EP1P、EP2P 和 EP3P)的特异性抗原结合功能，采用蛋白转
45、染试剂将 4 个重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、PE40)转入体外培养的血管内皮细胞(EAhy 926)，MTT 法测定 4 种蛋白的细胞毒活性。 548 只正常 BALB/c 鼠随机平均分为 8 组，分别间隙尾静脉注射 7 种经鉴定的重组蛋白和 PBS 共 2 周，眼静脉放血处死小鼠，取其脑、腮腺、肺脏、心脏、肝脏、肾脏制作组织切片，常规 HE 染色后病理检查，并分析检查结果。 结果 1获得 7 种重组蛋白(EP1P、EP2P、EP3P、EPE40、P1、P2、P3)，经鉴定，EP1P/P11、EP2P/P2、EP3P/P3 分别特异性识别 R060 抗原表位482493、31032
46、3、230241，重组蛋白 EP1P、EP2P、EP3P 和 EPE40 均具有明显的细胞毒活性。 2动物实验的病理检查显示：全部实验小鼠的脑、腮腺、心脏、肝脏、肾脏组织切片 HE 染色检查结果正常，但 EP1P 处理组小鼠较其他实验组出现明显的肺脏出血。 结论 1成功获得 R060 抗原 3 个不同表位的免疫毒素(EP1P、EP2P 和 EP3P)、实验对照用重组蛋白(P1、P2、P3 单抗及 PE40 毒素蛋白)，并证实他们具备应有的特异性抗原结合能力和/或细胞毒活性。 2初步动物实验的结果显示：所研究的 3 个 R060 抗原表位自身抗体可能不能独立导致正常个体始发自身免疫病，但部分 R
47、060 表位自身抗体在慢性炎症的背景下，可以成为损害组织器官的致病抗体，在这种背景下，不同 Ro60表位的自身抗体，可能导致不同的组织器官损害。 3实验获得的 3 个 Ro60表位免疫毒素及其实验对照用重组蛋白克隆、重组它们的方法、条件以及初步动物实验结果，为本课题进一步深入研究提供了工具和参考手段。研究背景 60kD SSA/Ro(R060)抗原广泛分布于正常人体的肝、肾、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞等组织细胞的胞浆和胞核中，抗 R060 抗体存在于多种自身免疫性疾病如：系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、新生儿狼疮(NLE)和系统性硬化症(SS
48、c)等，并与这些疾病中的多种临床损害如皮疹、反复腮腺肿大、肺损害、白细胞减少、心脏传导阻滞等相关。研究表明，Ro60 抗原拥有 20 个独立的抗原表位,不同表位的自身抗体可能会导致不同的临床损害，表现为不同的自身免疫病出现不同表位的自身抗体。本课题组的初步临床研究发现，不同的自身免疫病患者，抗 Ro60 抗体所识别的表位组成不同，且不同表位自身抗体与不同的临床损伤相关。 有研究证实，根据 R060 蛋白 20 个抗原表位氨基酸序列，人工合成的多肽仍保留其相应表位的抗原活性。为进一步探讨 Ro60 不同表位自身抗体与临床损害问的关系，本课题组首先成功构建了抗 Ro 抗体单链可变区(Single-chain Fv，ScFv)噬菌体抗体库，根据课题组初步临床研究的结果，人工合成 Ro60 抗原 3 个表位多肽(P1 表位：482493，P2 表位：310323，P3 表位：230241)，用 3 个多肽从 ScFv 噬菌体抗体库中筛选获得 3 个 ScFv 单抗lt;#39;17gt;。为了能直接观察这 3 个单抗可能导致的不同组织器官损害，了解它们在不同自身免疫病发生及发展中的作用，需要通过动物实验，分别用它们作用正常和各种自身免疫病的模型动物。缺少正常抗体 Fc 片断的 ScFv 单抗，只具有特异性抗原结合能力，没有免疫损害效能。将 ScFv 单抗与铜绿
