1、微生物学专业优秀论文 人 CR1 功能域 SCR15-18 在毕赤酵母中的表达及其对肠缺血再灌注损伤的保护作用关键词：肠缺血再灌注损伤 补体受体 1 型短 同源重复序列 补体抑制因子 毕赤酵母 蛋白表达摘要：肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺
2、血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor
3、 type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解 C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍C3/C5 转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母
4、中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片
5、段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BM
6、MY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实
7、验发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-
8、18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。正文内容肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化
9、的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是
10、由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解 C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍C3/C5 转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白
11、CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756
12、bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇
13、诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验发现：I/R 组的结果
14、与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补
15、体活性的功能，在体内对大鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL
16、 复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列(
17、short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍 C3/C5转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 N
18、i2+-NTA 树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获
19、得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-
20、PAGE 和Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增
21、加，MPO 活性和 MDA 含量显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性
22、肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、暴露的抗原和线粒体等
23、通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus
24、 repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍 C3/C5转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯
25、化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9
26、 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和Westem bl
27、ot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含
28、量显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用
29、。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个
30、补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成
31、的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍 C3/C5转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白 C
32、R1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not
33、 I 双酶切，胶回收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母
34、中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量显著升高，而 SOD 活性降
35、低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再
36、灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同时，补
37、体活化产物 C3a、C5a 和 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既
38、对经典、旁路、MBL 三个补体激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍 C3/C5转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外
39、抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回收后，两者按
40、一定比例用 T4 连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-
41、SCR15-18蛋白经 Ni2+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C
42、3 组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排
43、斥反应等疾病的防治奠定了基础。肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和 MBL 三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物 C3a、C5a 和
44、 C5b-9 均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在 C3 处汇合，通过 C3 转化酶裂解 C3，继而形成 C5 转化酶，裂解 C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此 C3/C5 转化酶是理想的抑制靶点。补体受体 1 型(complement receptor type1，CRl)是由 30 个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL 三个补体
45、激活途径的 C3/C5 转化酶有加速衰变作用，又有辅助 I 因子裂解C3b/C4b 作用的补体调节蛋白。其中 SCR15-18，能结合 C3b/C4b，阻碍 C3/C5转化酶的形成，辅助 I 因子裂解 C3b/C4b，进而抑制 C3/C5 转化酶，阻断和抑制 C5a 及 C5b-9 等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白 CR1-SCR15-18，用 Ni2+-NTA 树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白 CR1-SCR15-18 在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对
46、急性肠 I/R 损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人 CR1-SCR15-18 DNA 序列和 pPIC9 的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过 XholI 酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入 TAG 终止密码、6X HIS 标签和 Not I 酶切位点。以 pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了 CR1-SCR15-18 DNA 片段，片段大小为 756 bp。 2.将 PCR 扩增获得的目的基因片段和 pPIC9 质粒经 Xhol I+Not I 双酶切，胶回收后，两者按一定比例用 T4 连接酶连接，
47、构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR 和测序鉴定正确，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI 线性化 pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD 平板)筛选重组酵母菌。经 PCR 鉴定确认，成功筛选到 4 个阳性酵母转化子，命名为 pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY 增菌，换 BMMY 后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经 SDS-PAGE 和Westem blot 证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经 Ni2
48、+-NTA 柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18 蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠 I/R 动物模型。体内实验发现：I/R 组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO 活性和 MDA 含量显著升高，而 SOD 活性降低，肠组织原位有大量的补体 C3 组分沉积，病理损伤严重，肠
49、黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与 I/R 组相比，CR1 保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和 MDA 含量显著降低，而 SOD 活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体 C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了 CR1-SCR15-18 的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了 CR1-SCR15-18 蛋白，并证实纯化后的 CR1-SCR15-18 蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠 I/R 损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠 I/R 损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠 I/R 损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL 复合物
