1、临床医学(内科学)专业毕业论文 精品论文 -连环蛋白在急性肝损伤中的作用研究关键词：急性肝损伤 -连环蛋白 抗-Fas 抗体 病毒性肝炎摘要：一、研究背景和目的： -连环蛋白(-catenin)是 Wnt 信号通路中至关重要的成员之一，对细胞的生长、再生、分化等起重要的调节作用。胞浆中的 -catenin 分子在受到 Wnt 配体的刺激后与转录因子 Tcf4/Lef 结合形成转录复合物转运入核，启动下游靶基因如 c-Myc、CyclinD1、Survivin 等的转录和表达，调节细胞的生长和凋亡。同时，-catenin 又与跨膜黏附分子钙黏附素(cadherin)相连，参与细胞黏附。肝脏的众多
2、生理和病理过程与 Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 基因的异常改变密切相关。-catenin对于肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用，肝细胞癌和肝胚细胞瘤也与 -catenin 的异常改变有关。然而，Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 在急性肝损伤中的主要作用尚未明确。 急性肝损伤是一种非常严重的临床综合征，死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量饮酒和应用肝毒性药物是其诱因。大量肝细胞坏死和凋亡是急性肝损伤过程中十分重要的病理学特征。Fas 是介导凋亡信号通路的细胞表面抗原，当与特异的配体或抗体结合后可以启动半胱天冬酶级联，导
3、致细胞凋亡。小鼠给予抗 Fas 抗体(Jo2)后可通过诱导大量的细胞凋亡而引起死亡。细菌脂多糖(LPS)是一种强诱导物，可促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-(TNF-)和一氧化氮(NO)，诱导由氧化应激介导的急性肝损伤。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增强啮齿类动物肝脏对 LPS 刺激的敏感性，LPS 联合 D-GalN 可诱导小鼠急性肝损伤。 本实验将运用肝细胞特异性敲除 -catenin 的基因敲除小鼠分别建立抗-Fas 抗体和LPS/D-GalN 诱导的小鼠实验性急性肝损伤模型，分别研究 -catenin 在两种急性肝损伤模型中的作用。 二、材料和方法: 1从美国 Jackson 实验室引进
4、 B6.129-Ctnnbltm2Kem/KnwJ(在 -catenin 基因的内含子 1 和 6 中有 Lox P 位点)和 B6Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增强子/启动子支配的 Cre)小鼠，通过两种小鼠的 2 次杂交，繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin(-catenin KO)的小鼠并从基因表型(PCR)和肝细胞 -catenin 蛋白表达水平以及免疫组化(抗 -catenin 抗体)三方面进行鉴定。2选择雄性 6-8 周龄，体重约 18-23g Alb-cre：B-cateninloxP/loxP 小鼠，随机分为 Jo2 处理组(n=6)、LPS/D-Ga
5、lN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。同窝 Alb-cre；B-cateninlosP/+，-cateninloxP/+，-cateninloxP/loxP 共同做为对照组(Control)，随机分为 Jo2 处理组(n：7)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。Jo2 处理组腹腔注射 Jo2(0.5ug/g 体重)，LPS 处理组腹腔注射LPS(80ug/g 体重)+D-GalN(800ug/g 体重)。处理组于注射后 6h 脱颈处死，同时处死未处理组。3留取血清和肝组织标本，(1)通过检测血清转氨酶水平，HE染色研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo
6、2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤程度的影响。(2)通过 Real-time PCR 检测炎性因子(TNF-、IL-6、IFN-)的水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤炎症反应的影响。(3)、应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肝细胞凋亡情况，用 Western blot 方法检测肝细胞凋亡相关信号通路关键分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平，通过免疫组化的方法检测 P65 表达，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤中肝细胞凋亡情况以及凋亡
7、相关信号分予的改变情况。(4)检测 LPS/D-GalN 刺激后肝组织 iNOS 和 GSH 的表达水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对氧化应激的影响4应用 SPSS 统计软件对结果进行统计分析。 三、结果: 1繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠。对转基因小鼠的基因表型鉴定，肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的基因表型为：ctnnb 纯合(-/-)并且 Alb-Cre 阳性表达。免疫组化方面，野生型小鼠肝组织中内皮细胞和肝细胞表达 -catenin；肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的肝脏仅在内皮细胞的细胞膜上有 -catenin 染色，肝细胞未发现 -Ca
8、tenin 染色。应用抗-catenin 抗体进行 Western Blot 分析证明肝细胞特异性敲除 -catenin 基因的小鼠肝脏-catenin 基因表达水平明显低于野生型。 2在 Jo2 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组小鼠血清 ALT、AST 水平明显高于对照组，P0.05；实时定量 PCR 结果显示 IL-6、IFN- 水平略高于 Control 组； HE 染色结果(200X)见 -catenin KO 组窦状隙明显膨胀、充血，肝细胞大片嗜酸性坏死，局灶出血，小叶结构紊乱，少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；Control 组见窦状隙轻微肿胀、充血，少量肝细胞呈嗜酸
9、性变和坏死，小叶结构尚完整，局灶出血，散在淋巴细胞和中性粒细胞浸润。免疫组化结果 -catenin KO 组核阳性的 p65 染色少于 Control 组。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显高于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 -catenin KO 组活化的 Caspase-3、PARP 表达高于 Control 组，Bcl-2 水平低于对照组。 3在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组血清 ALT、AST 水平明显低于对照组(P0.05)；实时定量 PCR 结果显示
10、 -catenin KO 组 IL-6、iNOS 水平略低于 Control 组，Bcl-x1 水平高于对照组；HE 染色结果(200X)见 -cateninKO 组窦状隙散在膨胀、充血，炎细胞浸润，肝细胞片状嗜酸性坏死，局灶出血；Control 组见窦状隙严重肿胀、充血，大片状肝细胞坏死，炎细胞浸润，肝小叶结构紊乱。免疫组化结果 -catenin KO 核阳性的 p65 染色同 Control 组相比无明显差别。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显低于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 B-catenin K
11、O 组 Caspase-3、PARP 表达低于 Control 组，Bcl-2 表达高于对照组。肝组织 GSH 检测发现 -catenin KO组 GSH 水平高于 Control 组。 四、结论: 1肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 Jo2 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显高于对照组，提示-catenin 基因对 Fas 介导的肝细胞凋亡起保护作用，其机制可能与 -catenin 基因的抗凋亡作用有关。 2肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显低于对照组，提示-catenin 基因可加重由 LPS/D-Ga
12、lN 引起的肝损伤，其机制可能是 -catenin 参与了 LPS/D-GalN 诱导的氧化应激导致急性肝损伤。正文内容一、研究背景和目的： -连环蛋白(-catenin)是 Wnt 信号通路中至关重要的成员之一，对细胞的生长、再生、分化等起重要的调节作用。胞浆中的 -catenin 分子在受到 Wnt 配体的刺激后与转录因子 Tcf4/Lef 结合形成转录复合物转运入核，启动下游靶基因如 c-Myc、CyclinD1、Survivin 等的转录和表达，调节细胞的生长和凋亡。同时，-catenin 又与跨膜黏附分子钙黏附素(cadherin)相连，参与细胞黏附。肝脏的众多生理和病理过程与 Wn
13、t/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 基因的异常改变密切相关。-catenin对于肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用，肝细胞癌和肝胚细胞瘤也与 -catenin 的异常改变有关。然而，Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 在急性肝损伤中的主要作用尚未明确。 急性肝损伤是一种非常严重的临床综合征，死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量饮酒和应用肝毒性药物是其诱因。大量肝细胞坏死和凋亡是急性肝损伤过程中十分重要的病理学特征。Fas 是介导凋亡信号通路的细胞表面抗原，当与特异的配体或抗体结合后可以启动半胱天冬酶级联，导致细胞凋亡。小鼠给予抗
14、 Fas 抗体(Jo2)后可通过诱导大量的细胞凋亡而引起死亡。细菌脂多糖(LPS)是一种强诱导物，可促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-(TNF-)和一氧化氮(NO)，诱导由氧化应激介导的急性肝损伤。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增强啮齿类动物肝脏对 LPS 刺激的敏感性，LPS 联合 D-GalN 可诱导小鼠急性肝损伤。 本实验将运用肝细胞特异性敲除 -catenin 的基因敲除小鼠分别建立抗-Fas 抗体和LPS/D-GalN 诱导的小鼠实验性急性肝损伤模型，分别研究 -catenin 在两种急性肝损伤模型中的作用。 二、材料和方法: 1从美国 Jackson 实验室引进 B6.129-Ctn
15、nbltm2Kem/KnwJ(在 -catenin 基因的内含子 1 和 6 中有 Lox P 位点)和 B6Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增强子/启动子支配的 Cre)小鼠，通过两种小鼠的 2 次杂交，繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin(-catenin KO)的小鼠并从基因表型(PCR)和肝细胞 -catenin 蛋白表达水平以及免疫组化(抗 -catenin 抗体)三方面进行鉴定。2选择雄性 6-8 周龄，体重约 18-23g Alb-cre：B-cateninloxP/loxP 小鼠，随机分为 Jo2 处理组(n=6)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)
16、和未处理组(n=4)。同窝 Alb-cre；B-cateninlosP/+，-cateninloxP/+，-cateninloxP/loxP 共同做为对照组(Control)，随机分为 Jo2 处理组(n：7)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。Jo2 处理组腹腔注射 Jo2(0.5ug/g 体重)，LPS 处理组腹腔注射LPS(80ug/g 体重)+D-GalN(800ug/g 体重)。处理组于注射后 6h 脱颈处死，同时处死未处理组。3留取血清和肝组织标本，(1)通过检测血清转氨酶水平，HE染色研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-G
17、alN 诱导的肝损伤程度的影响。(2)通过 Real-time PCR 检测炎性因子(TNF-、IL-6、IFN-)的水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤炎症反应的影响。(3)、应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肝细胞凋亡情况，用 Western blot 方法检测肝细胞凋亡相关信号通路关键分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平，通过免疫组化的方法检测 P65 表达，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤中肝细胞凋亡情况以及凋亡相关信号分予的改变情况
18、。(4)检测 LPS/D-GalN 刺激后肝组织 iNOS 和 GSH 的表达水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对氧化应激的影响4应用 SPSS 统计软件对结果进行统计分析。 三、结果: 1繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠。对转基因小鼠的基因表型鉴定，肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的基因表型为：ctnnb 纯合(-/-)并且 Alb-Cre 阳性表达。免疫组化方面，野生型小鼠肝组织中内皮细胞和肝细胞表达 -catenin；肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的肝脏仅在内皮细胞的细胞膜上有 -catenin 染色，肝细胞未发现 -Catenin 染色。应用
19、抗-catenin 抗体进行 Western Blot 分析证明肝细胞特异性敲除 -catenin 基因的小鼠肝脏-catenin 基因表达水平明显低于野生型。 2在 Jo2 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组小鼠血清 ALT、AST 水平明显高于对照组，P0.05；实时定量 PCR 结果显示 IL-6、IFN- 水平略高于 Control 组； HE 染色结果(200X)见 -catenin KO 组窦状隙明显膨胀、充血，肝细胞大片嗜酸性坏死，局灶出血，小叶结构紊乱，少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；Control 组见窦状隙轻微肿胀、充血，少量肝细胞呈嗜酸性变和坏死，小叶结构尚
20、完整，局灶出血，散在淋巴细胞和中性粒细胞浸润。免疫组化结果 -catenin KO 组核阳性的 p65 染色少于 Control 组。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显高于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 -catenin KO 组活化的 Caspase-3、PARP 表达高于 Control 组，Bcl-2 水平低于对照组。 3在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组血清 ALT、AST 水平明显低于对照组(P0.05)；实时定量 PCR 结果显示 -catenin K
21、O 组 IL-6、iNOS 水平略低于 Control 组，Bcl-x1 水平高于对照组；HE 染色结果(200X)见 -cateninKO 组窦状隙散在膨胀、充血，炎细胞浸润，肝细胞片状嗜酸性坏死，局灶出血；Control 组见窦状隙严重肿胀、充血，大片状肝细胞坏死，炎细胞浸润，肝小叶结构紊乱。免疫组化结果 -catenin KO 核阳性的 p65 染色同 Control 组相比无明显差别。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显低于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 B-catenin KO 组 Caspase
22、-3、PARP 表达低于 Control 组，Bcl-2 表达高于对照组。肝组织 GSH 检测发现 -catenin KO组 GSH 水平高于 Control 组。 四、结论: 1肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 Jo2 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显高于对照组，提示-catenin 基因对 Fas 介导的肝细胞凋亡起保护作用，其机制可能与 -catenin 基因的抗凋亡作用有关。 2肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显低于对照组，提示-catenin 基因可加重由 LPS/D-GalN 引起的肝损伤，其
23、机制可能是 -catenin 参与了 LPS/D-GalN 诱导的氧化应激导致急性肝损伤。一、研究背景和目的： -连环蛋白(-catenin)是 Wnt 信号通路中至关重要的成员之一，对细胞的生长、再生、分化等起重要的调节作用。胞浆中的-catenin 分子在受到 Wnt 配体的刺激后与转录因子 Tcf4/Lef 结合形成转录复合物转运入核，启动下游靶基因如 c-Myc、CyclinD1、Survivin 等的转录和表达，调节细胞的生长和凋亡。同时，-catenin 又与跨膜黏附分子钙黏附素(cadherin)相连，参与细胞黏附。肝脏的众多生理和病理过程与 Wnt/-catenin 信号通路，
24、尤其是 -catenin 基因的异常改变密切相关。-catenin对于肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用，肝细胞癌和肝胚细胞瘤也与 -catenin 的异常改变有关。然而，Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 在急性肝损伤中的主要作用尚未明确。 急性肝损伤是一种非常严重的临床综合征，死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量饮酒和应用肝毒性药物是其诱因。大量肝细胞坏死和凋亡是急性肝损伤过程中十分重要的病理学特征。Fas 是介导凋亡信号通路的细胞表面抗原，当与特异的配体或抗体结合后可以启动半胱天冬酶级联，导致细胞凋亡。小鼠给予抗 Fas 抗体(Jo2)后可通过
25、诱导大量的细胞凋亡而引起死亡。细菌脂多糖(LPS)是一种强诱导物，可促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-(TNF-)和一氧化氮(NO)，诱导由氧化应激介导的急性肝损伤。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增强啮齿类动物肝脏对 LPS 刺激的敏感性，LPS 联合 D-GalN 可诱导小鼠急性肝损伤。 本实验将运用肝细胞特异性敲除 -catenin 的基因敲除小鼠分别建立抗-Fas 抗体和LPS/D-GalN 诱导的小鼠实验性急性肝损伤模型，分别研究 -catenin 在两种急性肝损伤模型中的作用。 二、材料和方法: 1从美国 Jackson 实验室引进 B6.129-Ctnnbltm2Kem/KnwJ(在
26、 -catenin 基因的内含子 1 和 6 中有 Lox P 位点)和 B6Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增强子/启动子支配的 Cre)小鼠，通过两种小鼠的 2 次杂交，繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin(-catenin KO)的小鼠并从基因表型(PCR)和肝细胞 -catenin 蛋白表达水平以及免疫组化(抗 -catenin 抗体)三方面进行鉴定。2选择雄性 6-8 周龄，体重约 18-23g Alb-cre：B-cateninloxP/loxP 小鼠，随机分为 Jo2 处理组(n=6)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。同窝 Al
27、b-cre；B-cateninlosP/+，-cateninloxP/+，-cateninloxP/loxP 共同做为对照组(Control)，随机分为 Jo2 处理组(n：7)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。Jo2 处理组腹腔注射 Jo2(0.5ug/g 体重)，LPS 处理组腹腔注射LPS(80ug/g 体重)+D-GalN(800ug/g 体重)。处理组于注射后 6h 脱颈处死，同时处死未处理组。3留取血清和肝组织标本，(1)通过检测血清转氨酶水平，HE染色研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤程度的影响。
28、(2)通过 Real-time PCR 检测炎性因子(TNF-、IL-6、IFN-)的水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤炎症反应的影响。(3)、应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肝细胞凋亡情况，用 Western blot 方法检测肝细胞凋亡相关信号通路关键分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平，通过免疫组化的方法检测 P65 表达，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤中肝细胞凋亡情况以及凋亡相关信号分予的改变情况。(4)检测 LPS/D-Gal
29、N 刺激后肝组织 iNOS 和 GSH 的表达水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对氧化应激的影响4应用 SPSS 统计软件对结果进行统计分析。 三、结果: 1繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠。对转基因小鼠的基因表型鉴定，肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的基因表型为：ctnnb 纯合(-/-)并且 Alb-Cre 阳性表达。免疫组化方面，野生型小鼠肝组织中内皮细胞和肝细胞表达 -catenin；肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的肝脏仅在内皮细胞的细胞膜上有 -catenin 染色，肝细胞未发现 -Catenin 染色。应用抗-catenin 抗体进行 W
30、estern Blot 分析证明肝细胞特异性敲除 -catenin 基因的小鼠肝脏-catenin 基因表达水平明显低于野生型。 2在 Jo2 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组小鼠血清 ALT、AST 水平明显高于对照组，P0.05；实时定量 PCR 结果显示 IL-6、IFN- 水平略高于 Control 组； HE 染色结果(200X)见 -catenin KO 组窦状隙明显膨胀、充血，肝细胞大片嗜酸性坏死，局灶出血，小叶结构紊乱，少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；Control 组见窦状隙轻微肿胀、充血，少量肝细胞呈嗜酸性变和坏死，小叶结构尚完整，局灶出血，散在淋巴细胞和中
31、性粒细胞浸润。免疫组化结果 -catenin KO 组核阳性的 p65 染色少于 Control 组。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显高于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 -catenin KO 组活化的 Caspase-3、PARP 表达高于 Control 组，Bcl-2 水平低于对照组。 3在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组血清 ALT、AST 水平明显低于对照组(P0.05)；实时定量 PCR 结果显示 -catenin KO 组 IL-6、iNOS 水平
32、略低于 Control 组，Bcl-x1 水平高于对照组；HE 染色结果(200X)见 -cateninKO 组窦状隙散在膨胀、充血，炎细胞浸润，肝细胞片状嗜酸性坏死，局灶出血；Control 组见窦状隙严重肿胀、充血，大片状肝细胞坏死，炎细胞浸润，肝小叶结构紊乱。免疫组化结果 -catenin KO 核阳性的 p65 染色同 Control 组相比无明显差别。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显低于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 B-catenin KO 组 Caspase-3、PARP 表达低于 Con
33、trol 组，Bcl-2 表达高于对照组。肝组织 GSH 检测发现 -catenin KO组 GSH 水平高于 Control 组。 四、结论: 1肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 Jo2 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显高于对照组，提示-catenin 基因对 Fas 介导的肝细胞凋亡起保护作用，其机制可能与 -catenin 基因的抗凋亡作用有关。 2肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显低于对照组，提示-catenin 基因可加重由 LPS/D-GalN 引起的肝损伤，其机制可能是 -catenin 参
34、与了 LPS/D-GalN 诱导的氧化应激导致急性肝损伤。一、研究背景和目的： -连环蛋白(-catenin)是 Wnt 信号通路中至关重要的成员之一，对细胞的生长、再生、分化等起重要的调节作用。胞浆中的-catenin 分子在受到 Wnt 配体的刺激后与转录因子 Tcf4/Lef 结合形成转录复合物转运入核，启动下游靶基因如 c-Myc、CyclinD1、Survivin 等的转录和表达，调节细胞的生长和凋亡。同时，-catenin 又与跨膜黏附分子钙黏附素(cadherin)相连，参与细胞黏附。肝脏的众多生理和病理过程与 Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 基因的
35、异常改变密切相关。-catenin对于肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用，肝细胞癌和肝胚细胞瘤也与 -catenin 的异常改变有关。然而，Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 在急性肝损伤中的主要作用尚未明确。 急性肝损伤是一种非常严重的临床综合征，死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量饮酒和应用肝毒性药物是其诱因。大量肝细胞坏死和凋亡是急性肝损伤过程中十分重要的病理学特征。Fas 是介导凋亡信号通路的细胞表面抗原，当与特异的配体或抗体结合后可以启动半胱天冬酶级联，导致细胞凋亡。小鼠给予抗 Fas 抗体(Jo2)后可通过诱导大量的细胞凋亡而引起死亡。细
36、菌脂多糖(LPS)是一种强诱导物，可促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-(TNF-)和一氧化氮(NO)，诱导由氧化应激介导的急性肝损伤。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增强啮齿类动物肝脏对 LPS 刺激的敏感性，LPS 联合 D-GalN 可诱导小鼠急性肝损伤。 本实验将运用肝细胞特异性敲除 -catenin 的基因敲除小鼠分别建立抗-Fas 抗体和LPS/D-GalN 诱导的小鼠实验性急性肝损伤模型，分别研究 -catenin 在两种急性肝损伤模型中的作用。 二、材料和方法: 1从美国 Jackson 实验室引进 B6.129-Ctnnbltm2Kem/KnwJ(在 -catenin 基因的内含子
37、 1 和 6 中有 Lox P 位点)和 B6Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增强子/启动子支配的 Cre)小鼠，通过两种小鼠的 2 次杂交，繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin(-catenin KO)的小鼠并从基因表型(PCR)和肝细胞 -catenin 蛋白表达水平以及免疫组化(抗 -catenin 抗体)三方面进行鉴定。2选择雄性 6-8 周龄，体重约 18-23g Alb-cre：B-cateninloxP/loxP 小鼠，随机分为 Jo2 处理组(n=6)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。同窝 Alb-cre；B-cateninl
38、osP/+，-cateninloxP/+，-cateninloxP/loxP 共同做为对照组(Control)，随机分为 Jo2 处理组(n：7)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。Jo2 处理组腹腔注射 Jo2(0.5ug/g 体重)，LPS 处理组腹腔注射LPS(80ug/g 体重)+D-GalN(800ug/g 体重)。处理组于注射后 6h 脱颈处死，同时处死未处理组。3留取血清和肝组织标本，(1)通过检测血清转氨酶水平，HE染色研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤程度的影响。(2)通过 Real-time
39、PCR 检测炎性因子(TNF-、IL-6、IFN-)的水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤炎症反应的影响。(3)、应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肝细胞凋亡情况，用 Western blot 方法检测肝细胞凋亡相关信号通路关键分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平，通过免疫组化的方法检测 P65 表达，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对 Jo2 和 LPS/D-GalN 诱导的肝损伤中肝细胞凋亡情况以及凋亡相关信号分予的改变情况。(4)检测 LPS/D-GalN 刺激后肝组织 iNOS 和
40、GSH 的表达水平，研究肝细胞特异性敲除 -catenin 对氧化应激的影响4应用 SPSS 统计软件对结果进行统计分析。 三、结果: 1繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠。对转基因小鼠的基因表型鉴定，肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的基因表型为：ctnnb 纯合(-/-)并且 Alb-Cre 阳性表达。免疫组化方面，野生型小鼠肝组织中内皮细胞和肝细胞表达 -catenin；肝细胞特异性敲除 -catenin 小鼠的肝脏仅在内皮细胞的细胞膜上有 -catenin 染色，肝细胞未发现 -Catenin 染色。应用抗-catenin 抗体进行 Western Blot 分析证明
41、肝细胞特异性敲除 -catenin 基因的小鼠肝脏-catenin 基因表达水平明显低于野生型。 2在 Jo2 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组小鼠血清 ALT、AST 水平明显高于对照组，P0.05；实时定量 PCR 结果显示 IL-6、IFN- 水平略高于 Control 组； HE 染色结果(200X)见 -catenin KO 组窦状隙明显膨胀、充血，肝细胞大片嗜酸性坏死，局灶出血，小叶结构紊乱，少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润；Control 组见窦状隙轻微肿胀、充血，少量肝细胞呈嗜酸性变和坏死，小叶结构尚完整，局灶出血，散在淋巴细胞和中性粒细胞浸润。免疫组化结果 -c
42、atenin KO 组核阳性的 p65 染色少于 Control 组。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显高于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 -catenin KO 组活化的 Caspase-3、PARP 表达高于 Control 组，Bcl-2 水平低于对照组。 3在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤模型中，-catenin KO 组血清 ALT、AST 水平明显低于对照组(P0.05)；实时定量 PCR 结果显示 -catenin KO 组 IL-6、iNOS 水平略低于 Control 组，Bc
43、l-x1 水平高于对照组；HE 染色结果(200X)见 -cateninKO 组窦状隙散在膨胀、充血，炎细胞浸润，肝细胞片状嗜酸性坏死，局灶出血；Control 组见窦状隙严重肿胀、充血，大片状肝细胞坏死，炎细胞浸润，肝小叶结构紊乱。免疫组化结果 -catenin KO 核阳性的 p65 染色同 Control 组相比无明显差别。TUNEL 法检测细胞凋亡可见每高倍视野 -catenin KO 组凋亡细胞个数明显低于 Control 组(P0.05)。Western Blot 检测发现 B-catenin KO 组 Caspase-3、PARP 表达低于 Control 组，Bcl-2 表达高
44、于对照组。肝组织 GSH 检测发现 -catenin KO组 GSH 水平高于 Control 组。 四、结论: 1肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 Jo2 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显高于对照组，提示-catenin 基因对 Fas 介导的肝细胞凋亡起保护作用，其机制可能与 -catenin 基因的抗凋亡作用有关。 2肝细胞特异性 -catenin 基因敲除小鼠在 LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤过程中肝损伤程度明显低于对照组，提示-catenin 基因可加重由 LPS/D-GalN 引起的肝损伤，其机制可能是 -catenin 参与了 LPS/D-GalN 诱导
45、的氧化应激导致急性肝损伤。一、研究背景和目的： -连环蛋白(-catenin)是 Wnt 信号通路中至关重要的成员之一，对细胞的生长、再生、分化等起重要的调节作用。胞浆中的-catenin 分子在受到 Wnt 配体的刺激后与转录因子 Tcf4/Lef 结合形成转录复合物转运入核，启动下游靶基因如 c-Myc、CyclinD1、Survivin 等的转录和表达，调节细胞的生长和凋亡。同时，-catenin 又与跨膜黏附分子钙黏附素(cadherin)相连，参与细胞黏附。肝脏的众多生理和病理过程与 Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 基因的异常改变密切相关。-cateni
46、n对于肝脏发育、肝细胞的增殖和凋亡具有重要调节作用，肝细胞癌和肝胚细胞瘤也与 -catenin 的异常改变有关。然而，Wnt/-catenin 信号通路，尤其是 -catenin 在急性肝损伤中的主要作用尚未明确。 急性肝损伤是一种非常严重的临床综合征，死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量饮酒和应用肝毒性药物是其诱因。大量肝细胞坏死和凋亡是急性肝损伤过程中十分重要的病理学特征。Fas 是介导凋亡信号通路的细胞表面抗原，当与特异的配体或抗体结合后可以启动半胱天冬酶级联，导致细胞凋亡。小鼠给予抗 Fas 抗体(Jo2)后可通过诱导大量的细胞凋亡而引起死亡。细菌脂多糖(LPS)是一种强诱导物
47、，可促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-(TNF-)和一氧化氮(NO)，诱导由氧化应激介导的急性肝损伤。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增强啮齿类动物肝脏对 LPS 刺激的敏感性，LPS 联合 D-GalN 可诱导小鼠急性肝损伤。 本实验将运用肝细胞特异性敲除 -catenin 的基因敲除小鼠分别建立抗-Fas 抗体和LPS/D-GalN 诱导的小鼠实验性急性肝损伤模型，分别研究 -catenin 在两种急性肝损伤模型中的作用。 二、材料和方法: 1从美国 Jackson 实验室引进 B6.129-Ctnnbltm2Kem/KnwJ(在 -catenin 基因的内含子 1 和 6 中有 Lox P
48、位点)和 B6Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增强子/启动子支配的 Cre)小鼠，通过两种小鼠的 2 次杂交，繁育出肝细胞特异性敲除 -catenin(-catenin KO)的小鼠并从基因表型(PCR)和肝细胞 -catenin 蛋白表达水平以及免疫组化(抗 -catenin 抗体)三方面进行鉴定。2选择雄性 6-8 周龄，体重约 18-23g Alb-cre：B-cateninloxP/loxP 小鼠，随机分为 Jo2 处理组(n=6)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。同窝 Alb-cre；B-cateninlosP/+，-cateninloxP/+，-cateninloxP/loxP 共同做为对照组(Control)，随机分为 Jo2 处理组(n：7)、LPS/D-GalN 处理组(n=6)和未处理组(n=4)。Jo2 处理组腹腔注射 Jo2(0.5ug/g 体重)，LPS 处理组腹腔注射LPS(80ug/g 体重)+D-GalN(800ug/g 体重)。处理组于注射后 6h 脱颈处死，同时处死未处理组。3留取血清和肝组织标本，(1)通过检测血清转氨酶水平，HE染色研究肝细胞特异性敲除 -cate
