1、临床检验诊断学专业毕业论文 精品论文 RNAi 沉默 Survivin基因抑制人胰腺癌 Patu 8988 细胞生长的实验研究关键词：RNA 干扰 胰腺癌 Survivin 基因 短发卡 RNA摘要：目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过
2、构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达的影响，以及对 Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析Survivin mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建 Survivin shRNA 重组质粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGen
3、esil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，RT-PCR 和 FCM 测定 Survivin mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染 Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表达的抑制作用； MTT测定细胞增殖能力，Western-blotting 测定 S
4、urvivin 蛋白的表达； G418筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重组质粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2和 pGenesil-1-NC 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百分比均大于 60；瞬时转染 48h，pGenesi
5、l-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和pGenesil-1-Survivin-1+2 对 Patu8988 细胞 Survivin mRNA 抑制率分别是空白对照组的 65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无差别； MTT检测各组细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FC
6、M 测得 Survivin 蛋白抑制率分别为 64.61、32.68和 59.49(与对照组相比，plt;0.05)，Western-blotting 结果与 FCM 结果基本相符； pGenesil-1-Survivin-1 组和pGenesil-1-Survivin-1+2 组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显著性(pgt;0.05)， pGenesil-1-Survivin-1 组、 pGenesil-1-Survivin-2 组和 pGenesil-1-Survivin-1+2 组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常
7、表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与 PI 检测细胞凋亡结果一致； 实验结果表明：pGenesil-1-Survivin-1 组对 Patu8988 细胞 Survivin 的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也最明显，略优于 pGenesil-1-Survivin-1+2组，pGenesil-1-Survivin-2 组干扰作用最差，而 pGenesil-1-NC 对 Patu8988细胞 Survivin 基因无明显干扰作用，对瘤细胞的增殖无明显影响。 结论： 成功构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivi
8、n-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC；三组重组质粒能在体内、外干扰 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达，抑制胰腺癌 Patu8988 细胞增殖；5-GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3和 5-GACTTCATAAGGCGCATGC-3可作为胰腺癌 Patu8988 细胞 Survivin 基因的 RNAi 靶点，前者明显优于后者。正文内容目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而
9、在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达的影响，以及对Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析 Survivin mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建
10、Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGenesil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和 pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，RT-PCR 和 FCM 测定Surviv
11、in mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表达的抑制作用； MTT 测定细胞增殖能力，Western-blotting 测定 Survivin 蛋白的表达； G418 筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定 Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重组质粒 pGenesil-1-Surviv
12、in-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百分比均大于 60；瞬时转染48h，pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2 对 Patu8988 细胞 Survivin mRNA 抑制率分别是空白对照组的65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无差别； MTT 检测各组细胞增殖速度的比较
13、表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FCM 测得 Survivin 蛋白抑制率分别为 64.61、32.68和 59.49(与对照组相比，plt;0.05)，Western-blotting 结果与 FCM 结果基本相符； pGenesil-1-Survivin-1 组和pGenesil-1-Survivin-1+2 组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显著性(pgt;0.05)， pGenesi
14、l-1-Survivin-1 组、 pGenesil-1-Survivin-2 组和 pGenesil-1-Survivin-1+2 组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与 PI 检测细胞凋亡结果一致； 实验结果表明：pGenesil-1-Survivin-1 组对 Patu8988 细胞 Survivin 的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也最明显，略优于 pGenesil-1-Survivin-1+2组，pGenesil-1-Survivin-2 组干扰作用最差，而 pGenesil-1-NC 对 Pa
15、tu8988细胞 Survivin 基因无明显干扰作用，对瘤细胞的增殖无明显影响。 结论： 成功构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC；三组重组质粒能在体内、外干扰 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达，抑制胰腺癌 Patu8988 细胞增殖；5-GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3和 5-GACTTCATAAGGCGCATGC-3可作为胰腺癌 Patu8988 细胞 Survivin 基因的 RNAi
16、 靶点，前者明显优于后者。目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达的影响
17、，以及对Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析 Survivin mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGenesil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil
18、-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和 pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，RT-PCR 和 FCM 测定Survivin mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表达的抑制作用； MTT 测定细胞增殖能力，Western-blotting 测定 Survivin 蛋白的表达； G418 筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤
19、重量，免疫组化测定 Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百分比均大于 60；瞬时转染48h，pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2 对 Patu8988 细胞 Surviv
20、in mRNA 抑制率分别是空白对照组的65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无差别； MTT 检测各组细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FCM 测得 Survivin 蛋白抑制率分别为 64.61、32.68和 59.49(与对照组相比，plt;0.05)，Western-blotting 结果与 FC
21、M 结果基本相符； pGenesil-1-Survivin-1 组和pGenesil-1-Survivin-1+2 组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显著性(pgt;0.05)， pGenesil-1-Survivin-1 组、 pGenesil-1-Survivin-2 组和 pGenesil-1-Survivin-1+2 组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与 PI 检测细胞凋亡结果一致； 实验结果表明：pGenesil-1-Survivin-1 组对 Patu8988 细胞 Su
22、rvivin 的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也最明显，略优于 pGenesil-1-Survivin-1+2组，pGenesil-1-Survivin-2 组干扰作用最差，而 pGenesil-1-NC 对 Patu8988细胞 Survivin 基因无明显干扰作用，对瘤细胞的增殖无明显影响。 结论： 成功构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC；三组重组质粒能在体内、外干扰 Patu8988 细胞 Survivin 基因
23、表达，抑制胰腺癌 Patu8988 细胞增殖；5-GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3和 5-GACTTCATAAGGCGCATGC-3可作为胰腺癌 Patu8988 细胞 Survivin 基因的 RNAi 靶点，前者明显优于后者。目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达
24、，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达的影响，以及对Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析 Survivin mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-
25、1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGenesil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和 pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，RT-PCR 和 FCM 测定Survivin mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表达的抑制作用； MTT 测定细胞增殖能力，
26、Western-blotting 测定 Survivin 蛋白的表达； G418 筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定 Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百
27、分比均大于 60；瞬时转染48h，pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2 对 Patu8988 细胞 Survivin mRNA 抑制率分别是空白对照组的65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无差别； MTT 检测各组细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-
28、2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FCM 测得 Survivin 蛋白抑制率分别为 64.61、32.68和 59.49(与对照组相比，plt;0.05)，Western-blotting 结果与 FCM 结果基本相符； pGenesil-1-Survivin-1 组和pGenesil-1-Survivin-1+2 组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显著性(pgt;0.05)， pGenesil-1-Survivin-1 组、 pGenesil-1-Survivin-2 组和 pGenesil-1-Survivin-1+2 组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免
29、疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与 PI 检测细胞凋亡结果一致； 实验结果表明：pGenesil-1-Survivin-1 组对 Patu8988 细胞 Survivin 的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也最明显，略优于 pGenesil-1-Survivin-1+2组，pGenesil-1-Survivin-2 组干扰作用最差，而 pGenesil-1-NC 对 Patu8988细胞 Survivin 基因无明显干扰作用，对瘤细胞的增殖无明显影响。 结论： 成功构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Surv
30、ivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC；三组重组质粒能在体内、外干扰 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达，抑制胰腺癌 Patu8988 细胞增殖；5-GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3和 5-GACTTCATAAGGCGCATGC-3可作为胰腺癌 Patu8988 细胞 Survivin 基因的 RNAi 靶点，前者明显优于后者。目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的
31、最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达的影响，以及对Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析 Survivin
32、mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGenesil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和 pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，
33、RT-PCR 和 FCM 测定Survivin mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表达的抑制作用； MTT 测定细胞增殖能力，Western-blotting 测定 Survivin 蛋白的表达； G418 筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定 Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重
34、组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百分比均大于 60；瞬时转染48h，pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2 对 Patu8988 细胞 Survivin mRNA 抑制率分别是空白对照组的65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无
35、差别； MTT 检测各组细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FCM 测得 Survivin 蛋白抑制率分别为 64.61、32.68和 59.49(与对照组相比，plt;0.05)，Western-blotting 结果与 FCM 结果基本相符； pGenesil-1-Survivin-1 组和pGenesil-1-Survivin-1+2 组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显
36、著性(pgt;0.05)， pGenesil-1-Survivin-1 组、 pGenesil-1-Survivin-2 组和 pGenesil-1-Survivin-1+2 组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与 PI 检测细胞凋亡结果一致； 实验结果表明：pGenesil-1-Survivin-1 组对 Patu8988 细胞 Survivin 的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也最明显，略优于 pGenesil-1-Survivin-1+2组，pGenesil-1-Survivin-2 组干扰作用最差
37、，而 pGenesil-1-NC 对 Patu8988细胞 Survivin 基因无明显干扰作用，对瘤细胞的增殖无明显影响。 结论： 成功构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC；三组重组质粒能在体内、外干扰 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达，抑制胰腺癌 Patu8988 细胞增殖；5-GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3和 5-GACTTCATAAGGCGCATGC-3可作为胰腺癌 Patu8988
38、 细胞 Survivin 基因的 RNAi 靶点，前者明显优于后者。目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu898
39、8 细胞 Survivin 基因表达的影响，以及对Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析 Survivin mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGenesil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-
40、Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和 pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，RT-PCR 和 FCM 测定Survivin mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表达的抑制作用； MTT 测定细胞增殖能力，Western-blotting 测定 Survivin 蛋白的表达； G418 筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌
41、荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定 Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百分比均大于 60；瞬时转染48h，pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2
42、 对 Patu8988 细胞 Survivin mRNA 抑制率分别是空白对照组的65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无差别； MTT 检测各组细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FCM 测得 Survivin 蛋白抑制率分别为 64.61、32.68和 59.49(与对照组相比，plt;0.05)，We
43、stern-blotting 结果与 FCM 结果基本相符； pGenesil-1-Survivin-1 组和pGenesil-1-Survivin-1+2 组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟，与空白对照组相比差异无显著性(pgt;0.05)， pGenesil-1-Survivin-1 组、 pGenesil-1-Survivin-2 组和 pGenesil-1-Survivin-1+2 组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达；透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少，与 PI 检测细胞凋亡结果一致； 实验结果表明：pGenesil-1-Survivi
44、n-1 组对 Patu8988 细胞 Survivin 的干扰作用最好，抑制瘤细胞的增殖也最明显，略优于 pGenesil-1-Survivin-1+2组，pGenesil-1-Survivin-2 组干扰作用最差，而 pGenesil-1-NC 对 Patu8988细胞 Survivin 基因无明显干扰作用，对瘤细胞的增殖无明显影响。 结论： 成功构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-NC；三组重组质粒能在体内、外干扰 Pa
45、tu8988 细胞 Survivin 基因表达，抑制胰腺癌 Patu8988 细胞增殖；5-GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3和 5-GACTTCATAAGGCGCATGC-3可作为胰腺癌 Patu8988 细胞 Survivin 基因的 RNAi 靶点，前者明显优于后者。目的： Survivin 是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein，IAP)家族成员之一，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达，其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖，逆转肿瘤形成。RNA
46、 干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达，已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建 Survivin shRNA 重组质粒转染胰腺癌 Patu8988 细胞，体内、外观察 shRNA 表达载体对 Patu8988 细胞 Survivin 基因表达的影响，以及对Patu8988 细胞生长的抑制作用，探讨 Survivin 基因在胰腺癌中的作用，为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。 方法： 软件分析 Survivin mRNA 结构以筛选出拟干扰靶位点，构建 Survivin shRNA 重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和
47、 pGenesil-1-Survivin-1+2，同时构建阴性对照重组质粒 pGenesil-1-NC，经酶切和测序鉴定后，提取各组重组质粒转染 Patu8988 细胞； 实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-2 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组和 pGenesil-1-NC 组，分别进行体内、外实验； 在 48 h 时检测细胞凋亡，RT-PCR 和 FCM 测定Survivin mRNA 和 Survivin 蛋白的相对含量，以观察各重组质粒瞬时转染Patu8988 细胞后对 Survivin 基因表
48、达的抑制作用； MTT 测定细胞增殖能力，Western-blotting 测定 Survivin 蛋白的表达； G418 筛选获得各重组质粒的稳定转染 Patu8988 细胞，接种 BALB/c 裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定 Survivin 蛋白表达，透射电镜观察瘤细胞超微结构，研究 Survivin shRNA 对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。 结果： 酶切和测序鉴定证实重组质粒 pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2 和 pGenesil-1-N
49、C 构建成功； FCM 测得各组转染细胞百分比均大于 60；瞬时转染48h，pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2 和 pGenesil-1-Survivin-1+2 对 Patu8988 细胞 Survivin mRNA 抑制率分别是空白对照组的65.62、54.89、64.96，与空白对照组相比差异具有显著性意义(plt;0.05)； FCM 检测五组凋亡指数都很低，各组无差别； MTT 检测各组细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-Survivin-1 组、pGenesil-1-Survivin-1+2 组转染细胞的增殖能力明显下降，pGenesil-1-Survivin-2 组细胞的增殖能力有一定下降，但不如前两者；FCM 测得 Survivin
