1、生物物理学专业优秀论文 HIV-1 P24 病毒载量试剂盒的研发关键词：艾滋病 病毒检测 抗原表达 细胞筛选摘要：获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA 病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广
2、泛的方法。但现有的RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度 P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒
3、。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆
4、抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24 抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。
5、其最低检出浓度可达72pg/ml。正文内容获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA 病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵
6、，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度 P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和
7、层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔
8、子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24 抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(
9、AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便
10、宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆
11、抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈
12、动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。
13、自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 H
14、IV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠
15、，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和
16、硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播
17、。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗
18、原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠
19、脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行
20、了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历
21、史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主
22、要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药
23、物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本
24、研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重
25、，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反
26、应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤
27、细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1
28、 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检
29、测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因
30、上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清
31、。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准
32、品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前
33、较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1
34、中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 H
35、IV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和
36、稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪
37、器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使
38、用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 HIV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚
39、型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。获得性免疫
40、缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于 1981 年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对 HIV 感染者进行 HARRT 治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的 RNA 病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临
41、床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24 抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行 HIV 病毒载量测定一种选择。本文对高质量的 HIV-1 P24 诊断用抗原、单抗、多抗，制备 HIV-1P24 病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： HIV-A1 P24 抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增 HIV-A1 P24 全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后 P24 基因插入到原核表达载体 pTXB1 中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌 BL21 中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化 P24 抗原，纯化效果大于 95。 H
42、IV-1 P24 单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与 sp2/0 细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到 4 株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有 P24 单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白 G 亲和层析的方法纯化 P24 抗原。 HIV-1 P24 多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的 HIV-B 亚型 P24 抗原免疫兔子，用 ELISA 方法检测兔子的体液免疫反应。最
43、后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有 P24 多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的 P24 兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的 P24 单克隆抗体、P24 多克隆抗体，制备了 HIV-1 P24 病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达 72pg/ml。特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正
44、文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c#x 刔 彟 2Z 皙笜?D 剧珞 H 鏋 Kx 時 k,褝仆? 稀?i 攸闥-) 荮vJ 釔絓|?殢 D 蘰厣?籶(柶胊?07 姻Rl 遜 ee 醳 B?苒?甊袝 t 弟l?%G 趓毘 N 蒖與叚繜羇坯嵎憛?U?Xd* 蛥?-.臟兄+鮶 m4嵸/E 厤U 閄 r塎偨匰忓tQL 綹 eb?抔搉 ok 怊 J?l?庮 蔘?唍*舶裤爞 K 誵Xr 蛈翏磾寚缳 nE 駔殞梕 壦 e 櫫蹴友搇6 碪近躍邀 8 顪?zFi?U 钮 嬧撯暼坻7/?W?3RQ 碚螅 T 憚磴炬 B- 垥 n 國 0fw 丮“eI?a揦(?7 鳁?H?弋睟栴?霽 N 濎嬄! 盯 鼴蝔 4sxr?溣?檝皞咃 hi#?攊(?v 擗谂馿鏤刊 x 偨棆鯍抰Lyy|y 箲丽膈淢 m7 汍衂法瀶?鴫 C?Q 貖 澔?wC(?9m.Ek?腅僼碓 靔 奲?D| 疑維 d袣箈 Q| 榉慓採紤婏(鞄-h-蜪7I冑?匨+蘮.-懸 6 鶚?蚧?铒鷈?叛牪?蹾 rR?*t? 檸?籕
