1、卵裂方式对胚胎发育潜能的影响 【摘要】目的： 探讨常规体外受精（IVF）后胚胎的卵裂方式对于胚胎发育潜能的影响，为优化胚胎筛选流程提供参考。方法：回顾性分析250例常规IVF周期的患者资料，通过时差成像技术（Time-lapse imaging，TLI）进行胚胎培养及动态观察胚胎的卵裂模式，其中2850枚非移植胚胎行囊胚培养。以囊胚质量为结局进行Logistic回归分析，建立优质胚胎的筛选标准。结果：回顾性分析显示，分裂方式为正常卵裂、不均、非轴性卵裂的胚胎具有较高的优质囊胚形成率（分别为5729%、4650%及4182%），大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、非对称卵裂、卵裂球碎裂、卵裂球融合及
2、混合卵裂模式的胚胎，其优质囊胚形成率较低（P 【关键词】时差成像技术；卵裂方式；胚胎评估 Influence of cleavage pattern on the potential of embryonic developmentWANG Shanshan， ZHAO Xia， NI Xiaobei， SUN Haixiang. Reproductive Medicine Center， Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China 【Abstract】Ob
3、jectives： To discuss the influence of embryonic cleavage pattern on the potential of embryonic development after conventional in vitro fertilization （IVF）， and to provide a reference for optimizing the embryo screening process. Methods： A retrospective analysis on the data of 250 patients with tradi
4、tional IVF cycle was done， namely embryos were cultured through time-lapse imaging （TLI） and the cleavage pattern of embryos was dynamically observed， of which blastocyst culture of 2850 non-transplanted embryos was finished. Logistic regression analysis was carried out by taking the quality of blas
5、tocysts as the end， and a screening criterion for good-quality embryos was established. Results： Retrospective analysis results showed embryos with normal cleavage， uneven cleavage and non-axial cleavage had high formation rates of good-quality blastocyst （57.29%， 46.50%， and 41.82% respectively）. T
6、he embryos with large fragmentation， developmental arrest， non-diploid cleavage， dissymmetric cleavage， fragmented blastomere， cell-cell fusion and mixed patterns had low formation rates of good-quality blastocyst （P 005，vs. normal cleavage group）， and thus could be used as an exclusion criterion fo
7、r embryo screening. Conclusion： The cleavage pattern helps to predict the embryonic development potential， improve the efficiency of embryo selection， and also gives a tip on traditional static morphological embryo assessment. 【Key words】Time-lapse imaging； Cleavage pattern； Embryo assessment 【中图分类号
8、】R167【文献标志码】A 在IVF实验室日常工作中，胚胎评估是一项核心、繁重的流程。为保证妊娠结局，胚胎选择是关键，而胚胎质量是内在发育潜能的体现，如何正确判断和选择具有良好发育潜能的胚胎已成为胚胎学研究的焦点。为实现快速、有效的胚胎挑选，必须简化筛选流程，获取最有意义的共性参数进行胚胎选择。 传统的静态形态学评估作为无损技术，是目前胚胎评估的主要手段。根据ESHRE胚胎学专业学组对分裂期胚胎形成的共识，在几个特定的时间点，以静态形态学参数（卵裂球数目、碎片程度、均一性等）为标准对胚胎质量进行评估和分级，选择评分最高的胚胎进行移植1。由于静态的形态学参数缺乏可量化的公认指标，具有一定局限性。
9、胚胎发育是动态的过程，从受精到囊胚的形成期间经历了复杂的变化，胚胎在每一个发育阶段都有其特征，发育过程也有其速度和延续性，时差成像系统（Time-lapse imaging，TLI）作为一种新兴的无创方法，为持续观察胚胎发育提供了可能，并提高了现有静态形态学评估的精确度和敏感度2。 迄今为止，国内外针对TLI的研究主要集中在细胞动力学参数方面。大量研究表明，通过TLI动态观察后进行胚胎挑选可有效提高囊胚的预测能力，改善妊娠结局3，4。近期有文献报道，TLI可提供胚胎分裂模式的影像，如没有经过2细胞期，由受精卵直接分裂至3细胞或更多细胞的异常分裂5，此类胚胎的囊胚形成率极低，发育潜能低下。而这种
10、现象在静态形态学观察中是无法发现的，如将此类胚胎进行移植，可导致高流产率等负面影响。此结果充分说明胚胎的卵裂模式对胚胎发育结局的重要性，应作为TLI挑选胚胎的参数之一。 本研究目的是通过TLI动态观察，研究胚胎发育过程中卵裂模式对于胚胎发育潜能的影响，建立系统的胚胎挑选标准，为优化胚胎筛选流程提供参考，也为静态形态学挑选胚胎给予提示。 1材料与方法 11研究对象 对2014年1月至2014年11月在南京大学附属鼓楼医院生殖医学中心治疗的250例常规IVF周期患者的胚胎资料进行回顾性分析。患者纳入标准：（1）周期数 2；（2）获卵数515枚；（3）月经第3d FSH 12 IU/mL；（4）女方
11、年龄 40岁。排除标准：男方因素不育、供卵、种植前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）等。 通过TLI（Primo Vision， Cryo Innovations Ltd， Budapest， Hungary）对来源于250例IVF周期的胚胎进行动态观察。于第3d进行分裂期胚胎移植后，对剩余的2850枚非移植胚胎进行囊胚培养，以观察胚胎的卵裂模式。所有患者夫妻双方签署知情同意书，并已通过鼓楼医院伦理委员会审批（No 2013068）。 12时差成像系统（TLI） Primo Vision TLI是实时的胚胎监测工具，将数码倒置显微镜置于传统培养箱内，控制台主机置于培养箱外，通过USB数据线与箱
12、内显微镜相连接，每5min拍照一次，安全、动态地监测胚胎发育过程。9孔集合培养皿（WOW皿，Cryo-Innovation）具有明确的位置标记，便于识别跟踪每一枚胚胎。 13人卵母细胞的采集与处理 应用常规促排卵方案 6，B超监测卵泡生长发育，待主导卵泡直径达18 20 mm后注射hCG 500010000 IU，36 h后B超引导下经阴道穿刺取卵。获取的卵丘-卵母细胞复合物经卵子洗涤液Gamete （Vitrolife， Sweden） 洗涤后，转入IVF （Vitrolife， Sweden）培养微滴中，置于37/6% CO2的传统培养箱培养。 14授精与胚胎培养 获卵3h后，按照1000
13、0条精子/卵母细胞的比例加精。精卵共孵育6h后机械剥离颗粒细胞，将受精卵转入提前预温的含有G1卵裂液 （Vitrolife， Sweden）的WOW皿中，置于TLI系统进行培养。第3d移植当日，除移植胚胎外，剩余非移植胚胎按照相同位置转入含有G2 （Vitrolife， Sweden）的WOW皿中继续囊胚培养，至第6d结束。 15胚胎卵裂模式及时间参数的定义 通过TLI系统动态观察记录胚胎的卵裂模式。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂及异常卵裂，其中异常卵裂模式包括：不均、非轴性卵裂、大碎片、非二倍性卵裂、发育阻滞、非对称卵裂、卵裂球碎裂及卵裂球融合，其定义如下：不均指卵裂球分裂时，形成两个大小不均等
14、的细胞；非轴性卵裂指当卵裂球分裂时，胚胎形成非轴向裂沟，同时卵膜及胞浆持续扭转；大碎片指卵裂球分裂过程中形成一个无核的大碎片；非二倍性卵裂指一个卵裂球直接裂解为两个以上的卵裂球；发育停滞指一个或多个卵裂球24h内停止分裂；非对称卵裂指一个卵裂球分裂后，在其它卵裂球分裂前发生第二次分裂；卵裂球碎裂指卵裂球完全裂成碎片；卵裂球融合指当一个卵裂球分裂成两个卵裂球后，又重新融合成一个卵裂球。当胚胎的卵裂模式包含一种或者一种以上的异常卵裂模式时，则称为混合方式。 16胚胎评估 根据ALPHA/ESHRE指南对囊胚的质量进行分级评估1。本研究中，囊胚评分 4BB（4BB，4BA，4AB及4AA）被定义为优
15、质囊胚。 17统计学分析 数据以均数标准差（s）或率（%）表示，采用 SPSS 180 软件对数据进行统计分析（SPSS Inc， Chicago， Illinois， USA）。用Logistic回归分析胚胎的卵裂模式与优质囊胚的关系，各组间率的比较采用2 检验，P 2结果 21患者一般资料 囊胚培养组中，周期数、患者年龄、体重指数、基础卵泡刺激素（Basal FSH）、促黄体生成素（LH）用量、平均获卵数、平均正常受精数及平均正常卵裂数资料见表1。 22胚胎各卵裂模式的发生情况 胚胎的卵裂模式包括正常卵裂和异常卵裂。其中正常卵裂发生率最高，占3246%（925/2850）；卵裂球融合及非对
16、称卵裂的发生率最低，分别为123%（35/2850）和214%（61/2850）。见表2。 表2胚胎卵裂模式的发生率分裂模式发生率n（%）正常9253246不均200702非轴性卵裂165579大碎片3601263发育阻滞80281非二倍性卵裂4631625非对称卵裂61214卵裂球碎裂218745卵裂球融合35123混合3431204共计285023卵裂模式与胚胎发育潜能的关系 在各卵裂模式中，正常卵裂的胚胎，其优质囊胚率较高，为5729%（530/925）；不均和非轴性卵裂模式的优质囊胚率相对较高，分别为4650%（93/200）及4182%（69/165）；大碎片、发育阻滞和非二倍性卵裂
17、的胚胎，其优质囊胚率较低，分别为1944%（70/360）、875%（7/80）及216%（10/463）（P 005，vs 正常卵裂组）；此外，非对称卵裂、卵裂球碎裂和卵裂球融合三组均无优质囊胚形成；混合模式组的优质囊胚率仅为1545%（53/343）（P 005，vs 正常卵裂组）。 胚胎卵裂模式与优质囊胚形成率的关系分析结果提示，大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、非对称卵裂、卵裂球碎裂、卵裂球融合及混合卵裂模式可作为胚胎筛选的排除条件。 3讨论 胚胎的卵裂是通过多次有丝分裂将大量的卵胞质分配到较小的、具核的细胞中的过程。而受精后早期胚胎卵裂球的分裂速度及各卵裂球所处的位置都是由储存在卵内的
18、母型mRNA及蛋白质所控制。Athayde等7研究报道，异常分裂模式在胚胎发育过程中普遍存在，并发现原核迁移、第一次异常有丝分裂、紊乱性分裂等异常分裂模式的胚胎发育潜能低下，严重影响妊娠结局。该结果提示，在实际工作中通过形态学参数静态评估的优质胚胎，部分可能表现为异常卵裂，此类胚胎的发育潜能有限，可通过TLI动态观察后排除。为优化胚胎筛选流程，本研究对胚胎的卵裂模式进行系统性归纳总结，结果表明大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、非对称卵裂、卵裂球碎裂、卵裂球融合及混合方式的胚胎，其优质囊胚形成率较低，可作为胚胎挑选的筛除条件。 胚胎出现非整倍体或基因异常是诱发卵裂模式异常的主要原因。不均是胚胎发育
19、过程中较为的常见卵裂形式，有文献报道不均胚胎的非整倍体率和卵裂球多核率均显著高于均一性好的胚胎8。同时，不均与正常卵裂胚胎的二倍体比例相似，对囊胚形成影响较小9。本研究结果显示，不均胚胎的优质囊胚率为4650%，并未显著影响胚胎的发育潜能。由于各研究对不均程度的判定不同，得出不均影响胚胎发育潜能的研究多以1/41/3为界10，11，本研究将不均的标准定义为最大卵裂球与最小卵裂球直径相差为1/5，程度较轻。 非二倍性卵裂、大碎片、非对称卵裂及卵裂球融合方式这四类胚胎从静态形态学角度观察，可能与正常卵裂的胚胎具有相似的发育潜能，但这些胚胎可能具有较高的染色体异常风险。Wirka等报道，非二倍性卵裂
20、的胚胎具有较低的囊胚形成率及种植率7，本研究结果显示，非二倍性卵裂的优质囊胚形成率仅为216%，胚胎的发育潜能较低下。本研究观察到在胚胎发育过程中，有球形大小的碎片形成。如何判定究竟是碎片还是卵裂球？我们将卵裂球是否含有DNA物质作为区分标准：卵裂球在Day 2前直径小于45 m或Day 3小于40 m，则判定为大碎片，大于此标准则为卵裂球12。另外，使用拮抗剂方案或精子活力较弱时，可能会增加卵裂过程中卵裂球融合的出现几率，不利于胚胎发育13。本研究中非二倍性卵裂、大碎片、非对称卵裂及卵裂球融合这四类胚胎的优质囊胚形成率均显著低于正常卵裂组（P 胚胎基因的转录激活，是胚胎从母型调控向胚型调控过
21、渡的启动。此时，胚胎开始合成自己的mRNA及蛋白质，不再依赖于母性遗传的mRNA及蛋白质。这种母源调控向合子调控的顺利过渡是胚胎能够正常发育所必需的。而胚胎出现发育阻滞可能由于这种过渡出现了障碍，停顿在某个特定的发育时期14。有研究提示，发育停滞的胚胎具有较高的染色体异常现象，此类胚胎大多是嵌合体和非二倍体15，16。本研究结果显示，发育阻滞的胚胎其优质囊胚形成率仅为875%，可利用价值较低，与以上研究结果一致。 通过TLI如何快速有效的挑选胚胎，优化筛选流程？不均及非轴性卵裂的胚胎具有较高的优质囊胚形成率，因此将这两种分裂模式作为优质胚胎的挑选标准。大碎片、发育阻滞、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂
22、、非对称卵裂及融合的卵裂模式，其优质囊胚形成率较低，可以作为挑选优质胚胎的排除标准。 TLI提供了先进的胚胎观察模式，实现了在稳定可控的培养环境中对胚胎进行实时连续观察，其提供的动态参数可提高胚胎评估的精确性，有助于胚胎学家准确预测胚胎发育潜能。由于促排方案、微环境、人员操作等影响，各中心总结出的卵裂模式的纳入与排除标准会有所差别。应用TLI动态观察卵子及胚胎发育，有利于优质胚胎的选择，是今后评估胚胎质量、预测胚胎发育潜能的新趋势。由于TLI尚未广泛应用，其建立的胚胎评估标准有待临床扩大样本后进一步验证。 参考文献 1Alpha Scientists in Reproductive Medic
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