1、1第 35讲 基因工程及其安全性1基因工程的诞生() 2.基因工程的原理及技术(含 PCR技术)() 3.基因工程的应用()4蛋白质工程() 5.实验：DNA 的粗提取与鉴定基因工程的操作工具1基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：无菌。(3)操作水平：DNA 分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体生物体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。2限制性核酸内切酶(简称：限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链 DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核
2、苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)结果：产生黏性末端或平末端。3DNA 连接酶(1)功能：缝合被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)不同 DNA连接酶的比较连一连2(选修 3 P6“寻根问底”改编)DNA 连接酶和 DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。答案：不相同。DNA 连接酶连接的是两个 DNA片段，而 DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。 4载体(1)常用载体：质粒，其化学本质是独立于拟核之外的双链环状 DNA分子。(2)其他载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(3)特点及意义特点 意义稳定并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外
3、源基因具有特殊的标记基因 便于重组 DNA的鉴定和选择限制性核酸内切酶 Mun和限制性核酸内切酶 EcoR的识别序列及切割位点分别是和 。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。答案：适合的质粒是。由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。 考向 1 限制性核酸内切酶、DNA 连接酶等酶的作用31(2016高考全国卷)图(a)中的三个 DNA片段上依次表示出了 EcoR、 Bam
4、H和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的 EcoR、 Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经 BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个 DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由图(a)可知，尽管 BamH和 Sau3A两
5、种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的 DNA片段具有相同的黏性末端，故被 BamH酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被 Sau3A酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的 DNA连接酶是 Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T 4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端。答案：(1) Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙 甲中
6、目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)Ecoli DNA连接酶 T 4DNA连接酶 T 4DNA连接酶4考向 2 载体的作用和特点分析2(2016高考全国卷)某一质粒载体如图所示，外源 DNA插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活( Ampr表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用 BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体
7、、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA复制所需的原料来自_。解析：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的
8、基本条件有：具有一个或多个限制酶酶切位点、具有标记基因、能够在宿主细胞中复制表达等。(2)由于未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，均不含氨苄青霉素抗性基因，因而在含有氨苄青霉素的培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因( Tetr)失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正
9、常生长。(3)噬菌体侵染细菌时，其进入细菌的 DNA，利用细菌细胞中的物质合成子代噬菌体的 DNA5和蛋白质外壳。据此推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素(3)受体细胞载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能
10、力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：基因工程的基本操作1目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)方法 从 基 因 文 库 中 获 取人 工合 成 利 用 mRNA反 转 录 合 成通 过 DNA合 成 仪 用 化 学 方 法 人 工 合 成 )利 用 PCR技 术 扩 增 )2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达
11、和发挥作用。(2)基因表达载体的组成(3)构建过程63将目的基因导入受体细胞项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞常用方法农杆菌转化法 显微注射法 转化法受体细胞体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞过程将目的基因插入到Ti质粒的 TDNA上导入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体 DNA上表达Ca2 处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？7(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以
12、整合到染色体的 DNA上？ (3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？答案：(1)目的基因是 Bt毒蛋白基因，载体是 Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。(2)采用的方法是农杆菌转化法。由于 Ti质粒上的 TDNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体 DNA上，而目的基因又插入到了 TDNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA上。(3)抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。 1(2017高考全国卷)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA序列的机
13、制。已知在人体中基因 A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白 A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因 A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白 A，其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因 A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白 A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因 A是否翻译出蛋白 A，可用的检测物质是_(填“蛋白 A的基因”或“蛋白 A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导
14、，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。解析：(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因 A含有内含子，基因 A转录出的产物中有与内含子对应的 RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的 RNA序列，无法表达出蛋白 A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体；噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程
15、的受体细胞。(4)常用抗原抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白 A的物质为蛋白 A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验8中，S 型菌的 DNA转移到了 R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。答案：(1)基因 A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的 RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白 A(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白 A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体2农杆菌侵染植物细胞后，能将 Ti质粒上的 TDNA插入植物基因组中。图示为利
16、用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答下列问题：(1)剪除 Ti质粒的某些片段、替换复制原点 O与添加抗生素的抗性基因 T的过程中，需用多种限制酶处理，原因是_，需用_“缝合”双链 DNA片段的平末端。(2)目的基因是指_和一些具调控作用的因子。由过程形成的基因表达载体中，目的基因的首端具有_识别和结合的部位。(3)过程常用_处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因 T的作用是_。(4)在过程前，常采用_技术检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否含有目的基因。答案：(1)不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列 T 4DNA连接酶 (2)编码蛋白质的基因 RNA聚合酶 (3)Ca 2 (CaCl2
17、溶液) 用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体 (4)DNA 分子杂交基因工程的应用与蛋白质工程1动物基因工程与植物基因工程(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。92基因诊断与基因治疗(1)基因诊断：又称为 DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。(2)基因治疗概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入取
18、自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗复合型免疫缺陷症。3蛋白质工程(1)概念(2)基本流程写出流程图中字母代表的含义：A转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。(4)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。考向 1 基因工程的应用分析1(2018济宁曲阜一中模拟)利用动物乳腺生产产品的技术称为动物乳腺反应器技术。青岛“崂山奶山羊乳腺生物反应器的研制”项目通过鉴定，该项目生产的药用蛋白具有表达效率高、成本低、安全性高、易于分离纯化的优点，可产生乙肝表面抗原及抗
19、凝血酶等医药产品，造福人类健康。下图为利用生物技术获得这一生物新品种和抗虫棉的过程，据图回答下列问题：10(1)在基因工程中，A 表示_，如果直接从苏云金芽孢杆菌中获得抗虫基因，过程使用的酶区别于其他酶的特点是_，B 表示_。(2)在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用_技术对目的基因进行了扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶有_。(3)基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括哪几部分？_。(4)将目的基因导入受体细胞的过程中，在过程中一般是采用_法，在过程中一般采用_。(5)由于转基因表达产物
20、存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么？_。解析：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割 DNA分子。经限制酶切割后露出黏性末端或平末端，而 DNA连接酶则能把目的基因和运载体连接起来构成重组 DNA。一个完整的基因表达载体至少包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。将目的基因导入受体细胞的过程中，受体细胞若是植物细胞可以用农杆菌转化法、花粉管通道法和基因枪法；若是动物细胞一般用显微注射技术。目的基因的检测与鉴定的方法有四种，蛋白质的鉴定一般采用抗原抗体检测。答案：(1)目的基因 一种限制酶只能识别一
21、种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割 DNA分子 重组 DNA分子(2)PCR(多聚酶链式反应) 限制酶、DNA 连接酶 (3)目的基因、启动子、终止子、标记基因等 (4)农杆菌转化 显微注射技术(5)从转基因羊的乳汁中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。如果出现杂交带，表明奶羊中出现了抗原蛋白；如果不出现杂交带，表明奶羊中未出现抗原蛋白考向 2 蛋白质工程的概念和过程的辨析2(2015高考全国卷)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将 P分子中 158位的丝氨酸变成亮氨酸，240 位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P 1)不但保留 P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的
