1、依达拉奉对心肺复苏小鼠脑的保护作用 DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.08.015 基金项目：深圳市科技计划项目（201103250）；龙岗区科技创新局基金（YS2011041） 作者单位：518172深圳，深圳市龙岗区人民医院急诊科（王合金），重症医学科（阳书坤、刘渠），心内科（黄战军）；深圳市人民医院（高占良）；深圳市疾病与预防控制中心毒理室（何建凡）心肺复苏（CPR）后的存活率和神经功能的恢复率依然很低1，主要的并发症为神经功能损害和多器官功能衰竭2。依达拉奉对缺血性脑损伤有保护作用，能改善缺血性脑损伤患者神经功能的预后。本研究拟通过检测复苏后小
2、鼠血清和脑组织匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）和S-100蛋白浓度变化，从而探讨早期使用依达拉奉对心肺复苏后小鼠脑组织的保护作用。 1材料与方法 1.1实验动物及分组 选择36只雄性、体质量在2030 g之间的清洁级昆明小鼠（深圳市疾病预防与控制中心提供），在室温条件，白昼各12 h交替、标准饲养1周后再进行相关实验。实验动物随机（随机数字法）分为3组：实验组（依达拉奉组）、对照组和假手术组（健康组）。 1.2方法 1.2.1模型制备心肺复苏模型的制作参照文献3-4进行。小鼠经腹腔注射乌拉坦（1 mg/g）麻醉，经口腔插22 G管，机械通气。维持体液平衡，在手术之前给予等渗盐水
3、15 l/g。左侧颈动脉插管测量血压（通过压力换能器与BL- 420E生物机能实验系统连接以监测动脉压）和心率。左侧颈静脉置管用于给药。 心脏骤停模型制备：经食管心室起搏诱发室颤，4极5F起搏电极经口插入食管约4 cm，电极近端与BL-420E生物机能实验系统的电生理刺激输出端相连。先测定心室起搏阈值（通常起搏电压为1518 V，脉宽58 ms），诱发室颤电压应高于起搏阈值35 V。采用连续快速起博诱发室颤，所需参数为：电压20 V、脉宽10 ms、频率20 Hz。当起搏90 s后暂停起搏并观察12 s，如心电图显示起搏诱发出来的室颤自动转律时，应立即再起搏30 s，直至诱发出的室颤持续存在、
4、或出现无脉性电活动或一条直线（无心电活动）为止，通常需要起搏90180 s不等。心脏骤停成功诱导标准为动脉血压消失和心电图证实出现心搏停止。在心搏停止期间，机械通气停止3 min。心搏停止3 min后，予以胸心外按压。人工手法进行胸外心脏按压，频率200次/min，按压深度为小鼠胸廓前后径1/3。同时给予肾上腺素（0.4 g/g），必要时给予2 J双相波电除颤。同时恢复机械通气。 机械通气潮气量为12 l/g，呼吸频率为150次/min，FiO2为1.0。当自主循环恢复后，呼吸频率减少为130次/min，同时FiO2调整为0.4。CPR不成功的标准心肺复苏10 min后仍无生命体征。肾上腺素在
5、CPR过程中最大剂量为重复使用3次。 1.2.2给药方法心肺复苏成功后实验组立即给予静脉注射依达拉奉注射液3 g/g，对照组给予注射等量的生理盐水。假手术组只进行相关手术操作，不制备心肺复苏模型。继续其他相关治疗。 1.2.3小鼠血清和脑组织匀浆SOD、MDA和S-100蛋白含量的测定复苏后12 h后全部处死所有小鼠，并采取断头法采取小鼠血液3 ml，3000 r/min离心15 min，取上清液，-70 冰箱保存批量检测。 取血后迅速打开大脑，取一侧脑组织，以脑组织（mg）：生理盐水（ml）=101的比例在盛有冰块的器皿中用匀浆机研磨成脑匀浆，4 下3000 r/min离心15 min，取上
6、清液进行上述指标检测。用化学比色法检测SOD、MDA浓度（试剂购置美国Beckman公司）。 使用酶联免疫吸附法进行血清学S-100蛋白含量测定（试剂购置南京建成生物有限公司）。上述操作严格按照试剂操作说明操作。 1.2.4脑细胞组织病理学观察取一侧大脑半球置10%福尔马林溶液固定 24 h。系列酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，常规制作石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色，显微镜下观察大脑皮层神经细胞学病理变化。 1.3统计学方法 计量资料均以均数标准差（xs）表示，运用统计软件SPSS 10.0进行分析，包括单因素方差分析、多组均数两两比较的Bonferroni法或Tamhane法检验和Pea
7、rson相关分析。以P 2结果 2.1复苏后小鼠心电图 复苏后小鼠心电图，见图1。 图1复苏后小鼠心电图2.2脑组织病理学变化 假手术组大脑皮层神经细胞核大，形态规则，核仁明显，尼氏小体可见，形态完整。对照组大脑皮层细胞核浓缩，核形态多样，核仁不清，尼氏小体未见，可见胞体变小，水肿明显。实验组脑细胞可见少许核浓缩，形态稍不规则，尼氏小体可见，细胞周围间隙稍增大，水肿不明显。见图1。 A：假手术组；B：对照组；C：实验组 图2各组小鼠大脑皮层的病理学改变（HE400）2.3各组小鼠血清SOD、MDA和S-100蛋白 依达拉奉组小鼠血清SOD质量浓度在心肺复苏12 h后较对照组明显升高，但低于假手
8、术组，差异具有统计学意义；同时结果表明，依达拉奉组小鼠血清MDA质量浓度较对照组明显降低，高于假手术组，差异具有统计学意义。血清S-100蛋白质量浓度检测显示，拉奉组小鼠血清S-100蛋白质量浓度较对照组明显降低，高于假手术组，差异具有统计学意义。见表1。表1各组小鼠血清SOD、MDA和S-100蛋白（xs） 结果表明，依达拉奉组小鼠脑组织匀浆SOD浓度较对照组升高，低于假手术组，但差异无统计学意义（P0.05）；依达拉奉组小鼠脑组织匀浆MDA浓度较对照组明显降低，高于假手术组，差异具有统计学意义（P0.05）；见表2。表2各组小鼠脑组织SOD、MDA和S-100蛋白浓度比较（xs） 小鼠血清
9、SOD与MDA质量浓度呈负相关，与S-100蛋白质量浓度呈负相关，r分别为-0.621，-0.463，P 3讨论 心肺复苏是危重疾病的抢救和治疗过程中经常遇到的问题， 复苏成功后由于长时间的缺血缺氧，脑组织可能造成不同程度的损伤。目前认为缺血-再灌注后氧自由基增多是导致脑损伤加重的主要原因5。在再灌注期间，由于线粒体功能障碍，导致大量的氧自由基生成。氧自由基能引起脂质过氧化、蛋白氧化和DNA断裂等损伤，从而进一步加速脑细胞死亡。这些复杂的级联损害可持续数小时甚至数日6。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的终末产物之一，可以反映脂质过氧化程度，超氧化物歧化酶（SOD）是机体内源性氧自由基清除剂，反映机
10、体氧自由基清除能力。S-100蛋白具有高度神经元特异性，且稳定性好，不受肝素、鱼精蛋白、溶血、低温等因素影响。当脑组织缺氧受损时，神经细胞和血-脑屏障通透性均增加，神经元胞浆内大量 S- 100蛋白释放入外周血。S-100蛋白被认为是检测早期脑损伤和判断预后的重要指标7-8。脑细胞对缺血缺氧十分敏感，特别是大脑皮层结构，对缺氧更为敏感，在其缺氧早期就有脑细胞的变性或坏死。脑细胞形态学上的改变也被认为是脑组织损伤的最直接的证据9。 CPR后的脑保护除了恢复有效的脑血供外，减少氧自由基的形成和清除氧自由基及抑制氧自由基的作用显得十分重要。目前国内外尚无有明确有效作用于心肺复苏后早期脑保护的药物。无
11、论是钙通道阻滞剂、糖皮质激素、镁制剂还是联合使用安定和镁制剂，其均能在改善患者的症状上起到一定的作用，但是目前尚未发现其能明显改善患者的预后6。因此，对CPR复苏后早期脑保护的药物的选择和使用是目前国内外研究的一个热点和难点。本研究结果表明，在成功进行心肺复苏后，使用依达拉奉组小鼠血清SOD浓度明显高于对照组，但低于假手术组；同时研究还显示，实验组MDA血清浓度明显低于对照组，但高于假手术组。血清S-100蛋白质量浓度结果类似于MDA。脑组织匀浆上述脑组织损害与保护指标检测结果与血清学结果类似。相关分析显示血清SOD与MDA质量浓度呈负相关，与S-100蛋白浓度呈负相关；MDA浓度与S-100
12、蛋白质量浓度呈正相关。病理学组织学形态结果表明，使用依达拉奉后能明显减轻脑细胞水肿，保护脑神经细胞。本研究结果表明依达拉奉对心肺复苏小鼠具有明显的脑保护作用。 参考文献 1廖晓星.心搏骤停后的脑保护策略J.中华急诊医学杂志，2010，19（1）：7-10. 2 Geocadin RG， Koenig MA， Jia X， et al. Management of brain injury after resuscitation from cardiac arrest J. Neurol Clin ，2008，26（2）：487-506. 3 李肖亮，单爱军，杜波，等. 急危重症患者继发性脑损伤
13、救治中脑保护的研究进展J/ CD.中华危重症医学杂志：电子版，2011，4（1）：47-52. 4 朱军，方向韶，符岳，等. 窒息法与室颤法心肺复苏动物模型的比较研究J. 中华急诊医学杂志，2011，20（1）：14-19. 5 陈寿权，何爱文. 心搏骤停后心脑损伤：线粒体相关途径J. 中华急诊医学杂志，2013，22（1）：8-10. 6 Geocadin RG， Koenig MA， Stevens RD， et al. Intensive care for brain injury after cardiac arrest ： therapeutic hypothermia and re
14、lated neuro protective strategies J.Crit Care Clin， 2006， 22 （4） ： 619 -636. 7 黄效模，汤旭，周厚荣，等.亚低温对窒息大鼠心肺复苏后S100B蛋白及胶质纤维酸性蛋白表达的影响J.实用医学杂志，2013，29（5）：715-718. 8 Dassan P， Keir G， Brown MM. Criteria for a clinically informative serum biomarker in acute ischaemic stroke： a review of S100B J. Cerebrovasc Dis ，2009 ，27 （3）： 295-302. 9 Hickey RW， Ferimer H， Alexander H， et al. Delayed， spontaneous hypothermia reduces neuronal damage after asphyxial cardiac arrest in rats J. Crit Care Med，2000， 28 （10） ：3511-3516. （收稿日期：2013-04-21）第 8 页 共 8 页
