1、第三章 培养基设计及优化,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。发酵培养基的作用：,满足菌体的生长 促进产物的形成,发酵培养基的要求, 培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。,理想的发酵培养基发酵成功的重要一环,各种因素的制约：原材料的成本、发酵工厂的位置，等等科学设计理论上依据：微
2、生物学、生物化学、细胞生理学，等等, 培养基的类型及功能培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型一、按纯度 合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定 天然培养基: 采用天然原料,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产 ?,培养大肠杆菌常用两种培养基,M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g，葡萄糖 2-10 MgSO47H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，p
3、H 7.0,LB培养基：胰蛋白胨（英国Oxoid ）10g，酵母提取物（Oxoid）5g, NaCl 10g，pH 7.2,二、按状态,固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。衣康酸、柠檬酸等种子培养,半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定、运动特征观察，等,液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,三、按用途（从发酵生产应用考虑）,培养基按其用途可分为孢子培养基：产大量孢子（营养不能太丰富）种子培养基：营养丰富，生
4、长繁殖，最后一级接近发酵培养基发酵培养基三种：既生长繁殖又合成产物；根据需要，分批补料, 发酵培养基的成分及来源,工业上常用的糖类 葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质 量指标, 糖蜜 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：黄血盐(学名三水合六氰合铁()酸钾。为铁
5、和氰形成的配位化合物,蓝色的普鲁士蓝沉淀 )。,发酵培养基的成分及来源,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入 一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应,发酵培养基的成分及来源,碳源（5%，1.5g）,竹红菌素固态发酵产色素,发酵培养基的成分及来源,二、氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无
6、机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH,选择合适的无机氮源有两层意义：1.满足菌体生长2.稳定和调节发酵过程中的pH,初始pH的影响: pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大,陈涛，中国酿造，2004,毛霉产蛋白酶的研究,2、有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例 玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯
7、乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例： 蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题,三、无机盐的微量元素四、生长因子、前体和产物促进剂1、生长因子:凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生
8、素等均称生长因子 2、前体:作用：前体有助于提高产量和组份用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸？青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：13.8/(0.337/0.6)*36=68%,用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化流加也有利于提高前提的转化率
9、GSH发酵,3、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂,味之素第三代赖氨酸菌种在种子罐中添加促进剂,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,第三节 发酵培养基的设计和优化,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的
10、较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,一、培养基成分选择的原则,菌种的同化能力：碳源和氮源代谢的阻遏和诱导合适的C、N比100（0.22.0）pH的要求,发酵培养基的设计和优化,发酵培养基的设计和优化,二、成分含量的确定,（一）、理论转化率与实际转化率,理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小,实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小,如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标,发酵培养基的设计和优化,例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转
11、化率计算如下 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为 C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*46 Y = = 0.57 162,发酵培养基的设计和优化,发酵培养基的设计和优化,（二）、实验设计,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,单因子实验,多因子实验：均匀设计、 正交实验设计、 响应面分析等,JMP,发酵培养基的设计和优化,三、培养基设计的步骤, 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；, 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；, 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由
12、于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。,竹红菌素响应面实验,Box-behnken试验设计水平及其编码,优化前后色素变化,发酵培养基的设计和优化,四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方,摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶培养基设计的第一步,反应器最终的优化的基础配方,摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大,例：,青霉素发酵,发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1%,发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等,发酵培养基的设计和优化,发酵培养基的设计和优化,例：丙酮酸发酵 葡萄糖，硫酸铵,磷酸二氢钾，硫
13、酸镁，硫胺素、生物素、烟酸、吡哆醇,摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础,无机磷对DY-TJ400菌株生产丙酮酸的影响,磷是微生物细胞的基本营养元素之一。核酸、磷蛋白、磷脂和许多辅酶中含有磷，磷也参与能量代谢和许多有机化合物的磷酸化（激活）作用。由于无机磷的水平与细胞的能量水平密切相关，无机磷浓度增加时磷酸戊糖途径的代谢活性降低，而酵解途径的活性大幅度提高。,不同Bio浓度下初始磷酸二氢钾质量浓度对丙酮酸发酵的影响,发酵时间为48 h,Mg2+对丙酮酸发酵的影响,在整个EMP过程中的10种酶大多数都需要Mg2+作为其辅因子，因此Mg2+对T. glabrata DY-TJ400的EMP途径
14、代谢至关重要,MgSO4对T. glabrata DY-TJ400丙酮酸发酵的影响,维生素对T. glabrata DY-TJ400丙酮酸过量合成的影响,丙酮酸处于微生物代谢的关键点，要使细胞大量积累丙酮酸，必须将其转化和降解途径全部切断。NA、VB1、VB6和Bio是催化丙酮酸转化和降解的4种酶的辅因子，由于营养缺陷型细胞自身不能合成这些维生素，因而阻断了丙酮酸的进一步代谢。,单一维生素对丙酮酸积累的影响,维生素浓度对T. glabrata DY-TJ400丙酮酸发酵的影响VB1，Bio，NA，VB6浓度分别为0.015 mg/L，0.02 mg/L，8 mg/L，0.4 mg/L，变化其中
15、一种浓度时其他浓度不变,发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方,五、培养基设计时注意的一些相关问题,原料及设备的预处理,原材料的质量,发酵特性的影响,在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。,发酵培养基的设计和优化,灭菌,在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提,有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。,Na2HPO4+CaCO3CaHPO4+Na2CO3,有些物质由于挥发和对热非常敏感
16、，就不能采用湿热的灭菌方法,发酵培养基的设计和优化,第四节、重组产品培养基的介绍,大肠杆菌、酵母高密度度培养：,碳源：葡萄糖、甘油,氮源：胰蛋白胨、酵母粉,无机盐：磷、镁等,重组产品培养基的介绍,种子培养基：LB（酵母抽提物，5g/L；胰蛋白胨，10；氯化钠，10）；四环素10 mg/L。预发酵培养基（g/L） 葡萄糖，25；酵母膏，5； 柠檬酸三钠2H2O，1； FeSO47H2O，0.1； MgSO47H2O，0.75； (NH4)2SO4，5； KH2PO4，5； 四环素10 mg/L； 微量元素液1 ml/L； 泡敌；发酵培养基（g/L） 葡萄糖，25； 酵母膏，12.5； 柠檬酸三钠2H2O，1.25；FeSO47H2O，0.25； MgSO47H2O，2； (NH4)2SO4，5； KH2PO4，6； 微量元素液2 ml/L； 泡敌；,本章小节：,发酵培养基的设计和优化,培养基菌体生长所需的营养以及其它必须的条件,了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以 及其中的基本概念,发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题， 掌握发酵培养基优化与设计的思路、了解其中的 方法,
