1、第五章 RNA转录后的剪接与加工,5.1 概述,真核生物基因的表达在时间和空间上存在明显的间隔，转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质内完成，因此不能像原核细胞那样几乎同步同时地进行。,RNA processing,5端加帽端形成poly A内含子的去除与外显子的连接链的断裂核苷酸修饰糖苷键的改变RNA编辑,5.2原核生物rRNA的转录加工,rrnA-rrnG,m4Cm N4,2-O-二甲基胞苷,5.3 原核生物tRNA前体的加工,1. tRNA前体分子的形式：不同的tRNA串联排列多个相同tRNA串联排列tRNA与rRNA混合串联排列,2.tRNA 前体的加工修饰,内切核酸酶使tRNA分子端成
2、熟RNA外切酶使tRNA分子端成熟在tRNA分子端添加CCAOH核苷酸的修饰与异构化, tRNA分子端成熟,A.参与的酶：RNase P RNase F RNase D RNase BN RNase T RNase PH RNase polynucleotide PNPase,B. 步骤,RNase P将tRNA前体分子水解，但是水解后的片段的3端与5端端仍还有额外的核苷酸RNase F从靠近3端处水解切割，对tRNA前体3端逐步加工RNase D从前体3端再逐个切除附加序列，修剪tRNA的3端在tRNA核苷酰转移酶的作用下添加3端CCA, tRNA分子5端成熟,由RNase P催化切除5端额
3、外核苷酸。该酶是一种核糖核蛋白，由两个亚基组成，大亚基是分子量约为125 kDa 的RNA,另外一个为分子量为14 kDa的蛋白质。,5.4 原核生物mRNA前体的加工,5.5 真核生物RNA的转录后加工,（一）剪接方式的分类 第一类：自我剪接内含子,又可分为型和型内含子 第二类：需蛋白质（酶）参与剪接的内含子 第三类：依赖sn RNP剪接的内含子,（二） 真核生物tRNA前体的转录后加工,1. 结构特点及加工概述A. 与原核生物的差异 基因组内的tRNA基因成簇排列,各基因间有一定间隔, tRNA前体是单顺反子,且各个tRNA可作为独立的转录单位 tRNA基因数目比原核生物多 tRNA基因有
4、内含子,需经过剪接加工,B. 特点,长度和序列没有共同性,一般有1646个核苷酸位于反密码子的下游内含子和外显子间的边界没有保守序列,因此tRNA前体的剪接方式不符合一般规律,需要RNase的参与 tRNA分子的二级结构：氨基酸受体臂、D环、TC环和反密码环,2. 加工过程,内含子的剪接tRNA前体分子中内含子的切除,两个tRNA半分子的连接3端添加CCA：在tRNA核苷酸转移酶（ tRNA nucleotide transferase）催化下进行3端添加,由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸核苷酸修饰 :甲基化酶、异戊烯转移酶、鸟嘌呤转糖苷酶、硫转移酶,（三） 真核生物rRNA前体的转录后加工
5、,1. 结构组成与特点小亚基: 1618S rRNA大亚基: 2628S rRNA 、 5S rRNA 和5.8S rRNA 基因拷贝数多,在基因组内成簇排列,成串重复数百次集中在核仁内,并由转录区（transcribed spacer）与非转录区（non-transcribed spacer, NTS）交替排列,2. rRNA前体加工的基本步骤,5端非编码序列的切除, 41 S中间产物的生成41S的RNA被切割成32 S（ S和5.8 S）与20S （18 S）两段32 S被剪切成 S和5.8 S，并且部分序列互补配对20 S被剪切成18 S 切割位点如何确定 核仁小分子RNA （small
6、 nucleolar RNA, snoRNA）参与核糖核酸酶对特定立体结构的识别 rRNA前体分子的甲基化,3. snoRNA的结构与功能, 结构特点a. Box C框/D框，C框的序列为AUGAUGA, D框为CUGA,可借助互补序列识别rRNA前体中甲基化和切割的位点b. Box H/ACA, H框为ANANNA，能识别假尿苷酸化位点, 功能,与蛋白质结合成snoRNP参与rRNA前体的加工box C/D具有互补序列，是指导rRNA中2-O-核糖的甲基化修饰系统， box C参与甲基的转移反应box H/ACA能形成茎环二级结构，与rRNA特定序列互补,(四) 真核生物mRNA前体的加工,
7、1. 5端的帽子结构及加工步骤,核苷酸磷酸水解酶从生长着的RNA 5端切去5端磷酸基团鸟苷酸7-甲基转移酶催化一分子游离GTP中的GMP攻击5端第二个磷酸，形成5 ，5-三磷酸的连接，阻塞了RNA的5端2 -O-甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, AdoMet）的甲基基团转移到cap-0帽子结构鸟嘌呤的N7位另外一分子甲酰基转移酶催化将另一分子的AdoMet连接到从5端的第二个核苷酸cap-1的2-OH 上，使之甲基化继续由甲酰基转移酶催化随后的cap-2的2-OH 甲基化及嘌呤核苷酸N7位甲基化，形成不同的帽子结构,2. 5端帽子结构的功能,对mRN
8、A的保护作用，是mRNA免受核苷酸酶从5端开始的降解使mRNA具有可翻译能力（translatability）有利于成熟mRNA从细胞核输送到细胞质,3. mRNA 3端的多聚腺苷酸化(polyadenylation),保护mRNA，提高mRNA在细胞质中的稳定性能增强mRNA的可翻译能力，在真核细胞的mRNA翻译过程中，有一种能结合在poly A上的蛋白质称为poly A结合蛋白I （poly A-bingding protein I, PAB I）,当PAB I结合在poly A时，mRNA的翻译从效率大大增强,4. 核内不均一RNA, 概述 核内不均一RNA(heterogeneous
9、nuclear RNA, hnRNA)的碱基组成与总DNA组成类似，所以又称为类似DNA的RNA(D-DNA) 与mRNA的关系a.有相同的序列b.在体外能作翻译模板，与mRNA有相同功能c.两者的5端都有帽子结构， 3端有polyAd.两者的转录合成都可以被高剂量放线菌素D抑制, hnRNA的结构特点,5端有帽子结构(5-cap)3端有polyA+结构帽子结构的下游3个寡聚U区，长度约30nt寡聚U区下游有重复序列茎环结构分布于编码区的两侧编码区为非重复结构，含有内含子, hnRNA的加工过程,a. 5端形成特殊的帽子结构(m7G5ppp5N1mpN2p-)b. 修剪链的3端，并加上poly
10、Ac. 通过剪接除去由内含子转录而来的序列d. RNA链内的核苷酸被甲基化,5. mRNA前体加工的简要过程, mRNA前体中内含子的结构特点a. 两端边界有共同序列，这些序列是mRNA前体的剪接信号b. 与第一类II型内含子剪接有些类似，必须形成套索结构（ lariat ）,区别在于真核生物的mRNA的剪接要求形成剪接体, 剪接体剪接的简要过程,a. 在内含子的5切断，通过5、 2键将内含子5-G与分支点A残基的2为连接成套索结构b. 在内含子的3端剪接位点，外显子1与外显子2连接，内含子以套索形式被释放,6. 真核生物mRNA前体的剪接机制, snRNP:由U1、U2、U4、U5 & U6
11、 snRNP组成a. U1 snRNP: 8中蛋白质与1种RNA链,b. U2 snRNP:,能与内含子的分支点共同序列互补，另外还与U6 snRNP碱基配对，协助snRNA在剪接体上定向,c. U4 snRNP:与U6 snRNP偶联形成配对的茎I和茎II，当剪接体装配时，U4与U6解离开后发挥作用。U4主要是结合U6直到在剪接需要U6时才释放它，使之参与5端剪接d. U5 snRNP :与其它snRNA或剪接底物pre-mRNA的保守区无明显的互补，但它的确同pre-mRNA的5和3端剪接位点有相互作用,e. U6 snRNP,与内含子5端剪接区域配对, 剪接体（spliceosome),
12、a. 概念 : mRNA前体在剪接过程中组装形成的多组分复合物，主要是由细胞核内小分子RNA和蛋白质组成b. 组成: 每种都含有1-2种snRNA和数种蛋白质因子, 剪接体的组装与循环,b. 步骤,早期剪接复合体的形成前剪接复合体的组装过渡复合物的形成剪接体内结构重排剪接产物的形成mRNA剪接产物和内含子的释放,Step 1. 早期剪接复合体的形成,U1 snRNP结合到pre-mRNA的5端剪接点上剪接因子(splicing factor I)又称BBP (branch point binding protein)结合到分支点上U2 snRNP的辅助因子U2AF (U2 auxiliary
13、factor)的65 kDa和35 kDa两个亚基分别结合到分支点和3剪接位点的AG碱基上在SR蛋白作用下，已经结合在5剪接位点的U1snRNP和结合在3剪接位点的SR/U2AF相互靠近，形成早期剪接复合物（early spliceosome complex),Step 2. 前剪接复合体的组装,在U2辅助因子U2AF协助下，U2 snRNP与内含子的分支点结合ATP水解释放能量使内含子180弯曲U1 snRNP和U2 snRNP两种复合物相互作用，使内含子端和3端靠近SR蛋白协助U1 snRNP和U2AF结合，使早期剪接复合体组建成跨越内含子复合物，即前剪接体复合物(pre-spliceos
14、ome complex),Step 3 过渡态复合物的形成,U4/U6和U5 snRNP开始参与，使得U6内部序列和U4的5端互补，前剪接体与U4 snRNP、U5 snRNP和U6 snRNP的三聚体结合U4与U6解离，U6在5端剪接位点由ATP激活取代U1，使得U4离开前剪接复合体，同时在ATP的激活下，U1离开前剪接体复合物，形成过渡态复合物,Step 4 剪接体内的结构重排,在ATP激活下，U6与结合于分支点序列的U2 snRNP的5端序列互补U1离开5端剪接位点后，U5能够与两个外显子的剪接位点互补，使剪接体内发生结构重排，从而形成有利于催化剪接反应的构象,Step 5 形成剪接产物
15、并释放,在剪接体被激活的情况下，形成剪接产物释放mRNA剪接产物和内含子,U5 snRNP环通过外显子1和外显子2接触，使两个剪接位点在空间上靠近，由于它能引导其它RNA区域到剪接体的适当位置，以催化剪接功能的发挥，故又将U5 snRNP环称为导向RNAb. U2 snRNP与内含子的分支点形成螺旋区域，分支点A周围的碱基对使A突出，该结构为II型内含子的一种核酶（ribozyme)结构，是催化剪接的活性中心,c. 剪接体组装过程中的重排反应,内含子5端剪接点与U1 snRNP的相互作用转变为与U6 snRNP间的相互作用U2 snRNP与分支点相互作用代替了在分支点上结合蛋白BBP与分支点的
16、相互作用U2 snRNP分子内部发生重排，形成茎-环构象的活化U4/U6之间RNA配对形成的茎II结构被破坏，U6 snRNP在其3端形成分子内的茎-环结构U4/U6茎I区配对被破坏，使游离的U6 snRNP与U2 snRNP相互作用，而形成U2/U6螺旋I,U2 snRNP的5茎-环结构被破坏使其5端游离，并与U6相应部分作用形成U2/U6螺旋II 至此，前剪接体转变为成熟的剪接体，剪接催化反应通过U4的释放启动，ATP水解供能,7. mRNA前体剪接中的转酯反应,概述:在成熟剪接体上完成剪接反应实际上是磷酸二酯键的转移，又称为转酯反(transesterification) 第一次转酯反应
17、, 第二次转酯反应,第二次剪接反应是外显子1的3端对内含子3端剪接点进行亲核进攻，U5 snRNA在反应中起着排布外显子的功能，使5端外显子移动、定位，然后在外显子I和II粗发生第二次转酯反应，形成5， 3-磷酸二酯键，产生两个外显子的连接物和一个具有套索结构的内含子,8. 真核生物mRNA前体的选择性剪接, 概述(alternative splicing):一个基因的初始转录产物在不同的分化细胞、不同的发育阶段、甚至不同的生理状态下，通过不同的剪接方式，可以得到不同的成熟mRNA和蛋白质产物。所产生的多个蛋白质即为同源体(isoform), 分类, 实例,降钙素(calcitonin),免疫
18、球蛋白重链pre-mRNA,9. RNA自我剪接, I型内含子, I型内含子剪接的模式, I型内含子结构, II型内含子剪接,II 内含子的结构特点及剪接机制,5GUGCGYnAG 3,10. 核酶,泛指一类具有催化功能的RNA分子。除具有剪接酶功能之外，还有核苷转移酶、RNA限制性内切核苷酸酶、磷酸转移酶和磷酸酯酶等多种活性 剪接型核酶 指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴随着形成新的磷酸二酯键，即转酯反应。具有序列特异的内切核酸酶、RNA连接酶等多种酶活性 剪切型核酶,核酶结构,(五) RNA编辑,概念: 将改变RNA编码序列的方式1. 核苷酸的替换2. 编辑改变了可读框生物学意义a. 能改变和补充遗传信息b. 能增加基因产物的多样性c. 和生物细胞发育与分化有关，是基因调控的一种重要方式d. 使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化e. 可能与学习和记忆有关,
