1、重组DNA技术,第 十 章,目 录,第 一 节自然界的DNA的重组 DNA Recombination,DNA重组,细菌的基因转移与重组,接合作用、转化作用、转导作用,转座重组 （自学）,同源重组,特异位点的重组（自学）,发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。,一、同源重组,Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤,两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Ho
2、lliday中间体通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holiday中间体,目 录,片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,片段重组体,拼接重组体,目 录,二、细菌的基因转移与重组,接合作用转化作用转导作用细胞融合,（一）接合作用,当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种DNA转移称为接合作用。,质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,
3、可接合质粒如 F 因子(F factor),（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来、再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径溶源菌生长途径,例,目 录,目 录,第 二 节 基因工程,DNA Recombination Technique,重组DNA技术的发展史,年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验
4、1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系,主要内容,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） DNA克隆,技术水平：分子克隆 即DNA 克隆 细胞克隆个体克隆（动物或植物）,DN
5、A克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA 。,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶
6、 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构
7、(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,Bam H,Bg l,+,+,（三）目的基因,cDNA基因组DNA,目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,（四）基因载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬
8、菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,1. 质粒 (plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,目 录,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用c
9、DNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2. 噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,M13噬菌体pUC系列的物理图谱,3. 粘性质粒(cosmid),酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,二、重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,目 录,（一）目的基因的获取,1. 化学合成法要求：已知目
10、的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）,* 1、化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,* 2、从基因组DNA文库获取目的基因,目 录,（二）克隆载体的选择和构建,若将外源基因连接到复制子(基
11、因载体)上,外源DNA就可以作为复制子的一部分在受体细胞内复制.在基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作,直接影响到基因克隆的成败.,（三）外源基因与载体的连接,1. 粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目 录,Bam H,Bg l,+,+,不同限制酶切位点（配伍末端）的连接,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,目 录,2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平
12、端粘端补齐或切平形成的平端,目 录,3. 同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,目 录,4. 人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目 录,受体菌条件安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造）限制酶和重组酶缺陷处于感受态,导入方式转化 转染 感染,（四）重组DNA导入受体菌,（五）重组体的筛选 1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker res
13、cue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹 2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,互补,目 录, 互补的检测,目 录,原位杂交,目 录,Southern印迹,目 录,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋
14、白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,目 录,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,目 录,目 录,（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生物制药,重组DNA医药产品
15、,目 录,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准. 能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式体细胞基因治疗 (somatic cell gene therap
16、y)性细胞基因治疗 (germ line gene therapy),1. 产前诊断2. 携带者测试3. 症候前诊断4. 遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物,转基因技术,转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受
17、到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。,转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是“分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达”,转基因动物构建过程,转基因载体的构建将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中对转基因动物进行鉴定,转基因的技术方法,DNA显微注射法克隆法胚胎干细胞技术逆转录病毒介导的基因转移精子载体法等各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法,转基因动物的鉴定,Southern杂交 确定外源基因的整合以及整合的拷贝数RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平Western杂交 确定外
18、源基因蛋白质的表达情况实时PCR（荧光定量PCR）,转基因技术的应用,（1）建立致病基因表达、调控的动物模型（2）动植物新品种的培育（3）各种基因工程产品的制备（4）探讨生殖细胞的基因治疗方法,囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。,核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。这样
19、的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体,为无性繁殖.1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件,核转移技术,克隆羊“多利”,基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,基因剔除技术,基因剔除程序,将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚.细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠.,基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制 单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活.单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等 多基因决定疾病模型 多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病,
