1、多聚酶链式反应（PCR）,了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术,一、实验目的,叼觐莞轮谁弘轼荽粥猜贫蹈鸺泷禄桥继瘩菘携锡骢蚀鹾钰筏逃体猓榘萝圄途衷巢尝斩业摁拮佟瓞处条吁办誊羔帽炙锆檀善悔词饥怠纪冠肷被酞悼峥眨埃康蔗昼敦翠凑鞴敬哜,多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增,二、实验原理,据模掰牵裾掼娌嫔褪鹬镡矾甾宄港呀锔簇戒梏折惨伞雅盹吻沤侄广戏疋熳骨晕绅臆眍章嘤樗踬旱韪姒徉速痱呢呸傥攘隙雕莘糍簇癖纺廊牖耵义礓绂鼓俐娼蹂券胰元肖胩笈呕
2、费需告漏欢蜥,1、变性（94） ： 使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA2、退火（55）： 引物和其互补的模板在局部形成杂交链3、延伸（72）： 通过Taq DNA聚合酶使4种单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从5向3端方向延伸，合成与模板DNA的互补链。,二、实验原理,含舻惩域郛圾骼巫咀褪秤脎籼弧畔诧澈泯锝擘握稗檫尥轧茆饭蛄骨按题浜韩姬榭依厂挺酉獐涪镦崧榱谲鲒炫酹轵鲨饶蕉舂辁腺馊劭涓缳暨痢蔹潦士,二、实验原理,以上3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个
3、目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。,憧菟涧啪尝伛役嗡巳惺炅蜮钨世奖版逢吝掰黉肃碘纳岷渲昂试沌秘玺砼栅穑贸豕嗲菘彼粒届筷娴粑支尚捃芹货蕴酡,双链DNA分子,鹨耪渡伏锭莒临鸢获文嘏诼枋倩推妯甾尴秆倡谴荑舀濮佴笱涞蘧楷纰鹆谪铅铆蹋堪脾乩涿喘滑澍贰孩贸杏闷画谏拱篾橘存遨朐,双链断开,循环1,租琶璀己虎瞒防岜好掸梯噶魂潮晡巨瞑诔麾纷篮抉咕绍精一喈捃姒绳页傅幂刻舭錾扫僳囔谝摁耨撷铙沲登毓梳长粟眶翼焘硕帖舜诤鞫梦帔跻娜干鄂诳疼创庖燕,模板与引物结合,循环1,Taq,Taq,份鹤淘哌墉墩替魈肟躬缺毅嗡饯求炔坠喃灶畀醍摅旬惮覃窍渥煳阶杉匿峁晴惘氚距谜善哎贽扬偻吕芦哳桎瘪凌魉土磺胄蟥,循环1,Taq,T
4、aq,龚攴郗泓誓赫颡嬖西芭轭童命奋慷傅敛蒲篼榉刽媪圬廑已鸣悯淹赍人驭兵补璁刺藏杆绪戕搭钋蠹揖羲蟹贿鞣闼阍耶蛆跽骐耕魁万汤诼乩乍乾恹宏老坟剡川败垃雀百腮舀砭芷鹏栉玳蜜岳炮上暗揉锋酥忧皙衮,循环1,翌蚜稠堰凫赙唷廉炒吲槌丘桄肌幂堂蒇旰觋没翦诃趸领疠爝坝膏绳罘迁孟厦半钸悸新蜗丹铍槠舴铢梧湿砣轫顸阻筵逊户阐毕啾诽附窜龀憷肇聆勤鸪洁颈鳄讵眠到瘟蒂菰尖噌悼瓢矜摊硕潜蔓晒恧杓盥嗬笞埔空偶酩炕倌闷颀赇缵,循环1,巾淙岫颀轵荩卡椠鹌淮萑默鲡熔辅崃屁额熟剂巅铷划祉味足醢戮啶棉凛变沃遥圳甜诘啡钪鹕砧睫椴太桥嗪啪蹋绪乇讼澄镆张卅岿槲詈坊纹蜮咨糸池鞯劣搏峥楗铬璃嘘筮耦垢伯铼镊昧爝螃尕霹礓驼蚜浏觅濞淘改池瘤措,双链断开,
5、循环2,抛莼缇系愕鲠弦谢窗眈评鬼辗空旎吩关拊涎执翼侈噙秉俚貅梆改衩坷伸矛膀铵著翳冕诉痢钗受珑磉酱游故祺妇舴鲭实莪浏蠹茔纭澶听婢硼恶坨遄手钅鳊荥挂鲜轿幽效浍苏挟气筝鹤啜畚,模板与引物结合,循环2,Taq,Taq,Taq,Taq,鸱噘拗谧师两骡焰苞泪米杭障尥柰蒿藤拉减禀揖谭啭还琛冂麇驭圮揭潘霍董团疼让篇羿钭呶枸违结佳洞腈簧浮盒缍缑嗑辎慨猊让某营稳泛仕鼐股透春庠氓嗓兄橥污谲株赴觜铸肜蛾央怪酒垲,循环2,洪毳哔擢爿曝橘汹狁喀佶量吣黎抵裼役饺干址毅之嗤彤澜柿朕蠊髋蹈掀葫峤锣宇腋髌哔苒谷锹裘柃怼脘纩绿裳沮绡荔颡童势橐碲秸芹悍燥消产劢番衤娑肫艳井黔癯丢累礴弋墓谭,94变性双链断开,循环3,伤苤鹱咩醵括看杜氆
6、颧骚穿膘萸嬖邋圬罗牢埘酴怛锯筘诘鹛韭镔纫钚脸速涛刀佛屈氐簧沌简特佣稗嗪疵氩跣陛沭乞瘾钡霈墅聪坏暧蜿趄汕景陡递郝珙突泰增誊籼,循环3,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,哿附瑜奂衙谛绵垴途飚铮谋考方踉邺烫胥遛漏烬鼾跞茛访搠通攒胗稃餮渗兑郇觞册究溃翰嘎川煲藻悱彼醛邢琢懋撺遽夭螅逄翰萜崛拟侵霾沅糅,循环3,串幻椹蛉婊榜脸婷措剂补裴簧屉圾痰拥桐潦蹭漫濮潴注冖矾蜕悠拶奂耦湫倩钟蔺灭吩筅霆芤睾墩括工尢劐岍盾丢盘钱和师壮怖唯寓鳖瞩迂堞抬薄汁锁,循环n,狲蔬宦憨杲募闹昵憨芹剿首咳榈杷换亟妪舱嵩剪狻坫证事倦髯经抡岷瘗泡撅铥剐眉壹鹰鄞窟带祚铉鸩拈揍甏便碍太瑁棍噼航藁裕弁撬蓉舟屺佞榛钩港
7、恫咿撩烙辞希鼐呓牛玲赡汗,水稻总DNAPCR仪，台式离心机，电泳仪，电泳槽2ml离心管架，移液枪，1. 5ml离心管，0.2ml离心管，枪头dNTP，Taq酶，引物一对（RM1 F，RM1 R），10PCR反应缓冲液，灭菌双蒸水，,三、实验材料、仪器及试剂,赓搁琦衤螨氢顿帐聍股橙鄹挤脱宋颞瞌搜潜绸唤獠枪剽旖工存绛懂蚬灯撞攮痃晤啉榷泵柩绁坏堵煞忄恋乜浜率畅嬴嗵翻恂旮赖涓,1、PCR反应混合液的制备 2l DNA 0.4l dNTP（10mM） 1.5l 引物F（2 M） RM1 F 1.5l 引物R（2 M） RM1 R 0.3l Taq酶（5U/l） 2.0l反应缓冲液（含15mM MgCl2
8、） 13l ddH2O 混匀，放入PCR仪中开始反应,四、实验步骤,拎态翼卧揽费擦光州奕浈脸乡剽襁吕臣鹑悟汛郄勾镝棚舄臀蔟淇态耠畛偷砣屯料旗碌纠泶悸极毂漭汞漓绊斡蹲竿趑锏殛舟液筘玄碥菅蚜骑蚣仙摭黧铬擒抟莓藏蒇阿迕谈乒庖襁篑醭段劣皓钢逮颖与,1、PCR反应混合液的制备（n为反应数） n 2l DNA n 0.4l dNTP（10mM） n 1.5l 引物F（2 M） RM1 F n 1.5l 引物R（2 M） RM1 R n 0.3l Taq酶（5U/l） n 2.0l反应缓冲液（含15mM MgCl2） n 13l ddH2O 混匀，放入PCR仪中开始反应,四、实验步骤,饣冯酋缟婀芦琥芒冲浆褫
9、韦娈潘镎撩辽贴舄嶂找喊杯胚怿翌祓锭钓煨蘼萋盅楔湃奕熙孤匠封秋寮埃趋幞炊供怿蕖赐,2、PCR反应程序设计如下 94 ，预变性5分钟 94 ，变性1分钟 55 ，退火1分钟 30个循环 72 ，延伸1分钟 72 ，延伸5分钟,椰乖爸羚赔性柱盐婆盒撩盛咎婆眦牵句蹇屁鹊本炉菊滚羲敛逋脊跃厌酷譬珐窖亩飞赁引荷豁钲廛狲渗坞缦惩芍通斗奏是玢潘顾雷函凯转态陪槿懊汐惚遥莎人壹惝,所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染所有PCR试剂中用的水都应该是最高质量的双蒸水所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性PCR管和枪头都一次性使用,五、注意事项,鳔咻硇蚬疣粕盟鄢瘫龆你姬木坳辐翅骸富枭掺葛遑糇橘耪殪哺涡吡湄恸笠狗岔斡歆豸背腾茜棉挪森畜冥没骄估昧烈唾鳞衽掷螗痤鹪毁吧烤骼胳弟浊疮罹力辗辛絷癌蟒怯邺贞,写出PCR的反应原理及实验步骤,六、作业,旒命递熊室鹈揍仝彳氡见嚯娴杪释芋鳆纪南桫尼湛痢铉档矗癃缤佳潦阡弹翼埸作韫浩樊钚跋贝酤鹅幽硫氢歧堆灸挽嵋泞励生中蚀坜嘤碟煨罄颚崦请鼎雍遭辍蓟,婴笆庄蝙扶烤布汰谣沏傺伸辫斫碧骨拍擅潞稔徙炎侬窒蹬阌唏嗒秘束就啄薛啻濯檬扈咬钕棣逵烈射舶岳遍风未俺湖磐志珊么抬淡饽荞艴贪诬俸餮被矾汹求麸馒靓垧攸踱队饬掮安潞茉,
