1、IL-35对小鼠的型糖尿病的治疗效果评定及免疫机制的研究,预防医学本科二班组长：龙鑫鑫（5111410062）组员：刘雪贞（5111410061） 吕琼 （5111410063） 孟阳 （5111410064） 孙哲 （5111410069） 刘磊 （5111410089） 孟凡顺（5111410091）,目录,1.立题依据2.实验目的3.实验对象4.实验材料5.实验步骤及方法6.预期结果及结论7.实验可行性分析8.参考文献,自身免疫性疾病（Autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。如今越来越多的自身免疫性疾病被不断发现和认识，也越来
2、越引起人们的关注。型糖尿病(T1DM 自身免疫性胰腺炎)就是其中的一员，其机制是体内除了抗原提呈细胞（APC）和活化的T淋巴细胞外正常细胞几乎不表达MHC-类分子，研究表明IFN-转基因小鼠的胰岛细胞分泌IFN-，由于IFN-刺激MHC-分子的表达这种小鼠的胰岛细胞高表达MHC-类分子，这样以来免疫细胞就会结合并识别胰岛细胞然后对其进行攻击，使其丧失胰岛素分泌活性，最终导致体内胰岛素缺乏。临床发现人体发病机制与鼠基本相同，患者往往需要终生注射外源性胰岛素来控制体内的血糖水平。型糖尿病的发病率虽然较低，在全球大约有2000万患者，中国至少有100万的患者，但是型糖尿病常常在幼儿和青少年时期发生且
3、为一种多基因遗传病有较高的遗传度（75%），表现为明显的家族遗传性。同时，型糖尿病患者如治疗不善将引发严重的并发症，如失明、肾衰竭、心脏病、截肢等。因此如果能正确了解型糖尿病的免疫学机制，制定更加有效治疗及预防方案，对于患者本身乃至整个家族的身体和生活质量的提高意义重大。,关于型糖尿病的介绍,白细胞介素-35（IL-35） 是07年新发现的一种独特的免疫抑制性细胞因子，属于IL12细胞因子家族，IL-35为异源二聚，主要由活化的调节性T细胞（Treg）分泌，对多种免疫细胞和细胞因子均有明显的抑制作用，参与介导机体免疫耐受的形成。尽管通过调节性T细胞介导免疫治疗为病患带来了希望，但是这些能抑制免
4、疫系统活性的细胞分子至今对它们的了解很少，目前已经发现的只有IL-10，TGF，IL-35三种，这也是这一领域滞后的一个重要原因。以往典型的细胞因子的功能往往都是帮助激活免疫系统，而全新的细胞因子IL-35却荣幸的成为了少数几个能抑制免疫系统的细胞因子中的一员，重燃了人们对免疫抑制领域的希望。众多科学家们甚至认为也许有一天，控制住IL-35的水平就能控制免疫应答的升降，从而控制某些疾病。尽管如此现如今对IL-35的研究却遇到众多瓶颈，如IL-35是否为调节性T细胞（Treg)特异抑制因子？哪些细胞类型对其抑制活性敏感等，仍有待继续研究和解决。,关于白细胞介素-35,调节性T细胞（Treg)是近
5、年来研究的热点，是一些CD4+Tcell还可高表达IL-2受体的链（CD25）分子，胞质中表达Foxp3转录因子的T细胞分化亚群。它的主要功能是通过抑制CD4+Tcell和CD8+Tcell的活化与增殖从而达到免疫的负调节作用。,关于调节性T细胞,本实验就是通过提高NOD系小鼠（型糖尿病患鼠）体内的IL-35水平，观测小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的型糖尿病发病率、胰岛炎评分等，评定IL-35对型糖尿病的预防及治疗效果，并与其它一些免疫抑制性的药物（环孢菌素A）等，进行药敏对比；体外测定小鼠体内IL-4及干扰素-（IFN-）的等含量及T淋巴细胞的亚群分化情况及调节性T淋巴细胞的含量等，对小鼠的
6、免疫体质及IL-35对型糖尿病作用的免疫学机制有大体认识及方向把握，为以后的研究打下基础。为免疫抑制性新药（联合药）的开发及免疫抑制领域的深入研究有一定意义。,实验目的,NOD系和NON系（正常不患病个体）小鼠 起源 在对ICR/Jcl小鼠进行近郊培育的第6代，从白内障易感亚系分离出非肥胖糖尿病品系（NOD）和非肥胖正常品系（NON）。在近交20代时，首先发现NOD雌鼠有胰岛素依赖性糖尿病。特征 自发型糖尿病以及多种自身免疫疾病小鼠。通过病理学观察发现，NOD小鼠自身免疫性胰岛炎发生于4周龄。NOD小鼠发病后，充分呈现该品系小鼠糖尿病的生理生化特征即：尿频多饮高血糖症状。在几周的时间內，血糖迅
7、速升高，饮水量剧增，大量的排尿，体重迅速下降，在这个过程中，患鼠血糖呈现迅速上升，后逐步下降，但仍维持高于正常值的状态，体重直线下降，最后昏迷而死亡。于12周龄时出现明显糖尿病症状，至30周龄时雌性小鼠累计发病率可达到80。,知己知实验对象,试剂及仪器 IL-35试剂，磷酸盐缓冲液(PBS), 酶联免疫吸附试验（ElISA）试剂盒，流式细胞仪，CD8及CD4单克隆抗体，注射器等基础实验器械。,实验材料,实验方法及步骤,小鼠的分组与处理,从各组小鼠10周龄开始每周记录体重，每天采取断尾方式测血糖含量和尿糖含量，血糖连续2天超过16.00mmol/L即诊断为糖尿病,30周后观察期满终止观察，计算各
8、组小鼠发病率；,糖尿病及体重检测,30周后，颈椎脱臼法处死各组小鼠，取各组小鼠胰岛做HE色切片进行病理性胰岛炎评分。评分标准：1 0级：胰岛完整无淋巴细胞浸润，计0分；2 1级：有胰岛周围淋巴细胞浸润（即胰岛周围炎）或 2级：浸润至胰岛內，25%50%的面积受累,计2分；4 3级：50%的面积受累，计3分。记录各组小鼠评分值,胰腺炎严重程度评分,取足等量的各组小鼠外周血用ELISA法检测IL-4及干扰素-（IFN-）的含量，因为IFN-指导Th0向Th1方向、分化IL-4指导Th0向Th2方向分化。,细胞因子水平测定,取各组小鼠脾脏制成单核细胞悬液，应用细胞流式法进行T淋巴细胞亚群（主要是细胞
9、免疫）计数，结果用百分比表示。,T淋巴细胞亚群测定,分选提取大鼠脾脏和淋巴结CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞 并进行纯度和活性检测。用免疫磁珠两步法既阴性选择和阳性 选择分选提取小鼠CD4+CD25+调节性T细胞,流式细胞仪检测细胞 纯度,台盼蓝染色法观察计算细胞存活率。,细胞CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞,应用实验常用统计学软件（SAS,SPSS等）进行大量数据的后处理，整理待分析。,统计学处理分析,预期结果 实验组小鼠的发病率远低于对照组小鼠发病率，体重较对照组重；且对照组饮食饮水量远多于实验组和正常对照组；血糖和尿糖含量比对照组低并接近于正常对照组（可偏高）；IL-
10、4及干扰素-（IFN-）的含量实验组数据远低于对照组和正常对照组鼠，提示实验组发生了免疫的抑制（免疫的耐受）；实验组T淋巴细胞亚群分化度和活性较对照组和正常对照组明显偏低；调节性T（Treg）细胞实验组计数和活性较对照组和正常对照组高，提示有免疫抑制及耐受。,预期结果及结论,预期结论 IL-35对型糖尿病有明显的抑制或治疗作用；由于IL-35使Th0细胞向调节性T（Treg）细胞分化（优势分化方向）从而抑制T淋巴细胞的其他效应性分化（主要有Th1和Th2方向）使IL-2、IL-4及IFN-等主要免疫增强因子的分泌减少，有效抑制了荷主的免疫能力，从整体水平上降低自身免疫病的发生； Treg的活性
11、增值又能分泌IL-35和促进Fas 、Fasl途径激活相关基因致使T淋巴细胞凋亡，以上两项从整体水平上降低自身免疫病的发生；IFN-分泌的减少还能抑制胰岛细胞产生MHC-类分子使T淋巴细胞不能对其产生杀伤作用，从而不会引起免疫细胞对自体胰岛细胞识别与破坏，保证了胰岛细胞的正常胰岛素分泌功能，维持血糖的正常。,虽然没有用直接注射免疫抑制细胞因子来治疗自身免疫病的相关报道，但本实验设计方案合理；分组、对照完备；体内和体外实验兼有；技术方法和路线可行；通过免疫学基础实验和理论的学习，已掌握免疫细胞、免疫分子的检测技术（ELISA法），具有可操作性；实验所需药品、试剂及动物均较易获得，具备开展实验的条
12、件。,实验可行性分析,【1】 金伯泉医学免疫学 第五版北京：人民卫生出版社，2008【2】 宋文刚免疫学实验教材北京：北京大学医学出版社，2010【3】 孙黎飞细胞免疫学实验研究方法北京：人民军医出版社，2009【4】 王培林，傅松滨医学遗传学第三版北京科学技术出版社2011【5】 哈佛医学院Brigham and Womens医院，eBioscience公司的科学家Nature罕见的抑制性因子美国2007【6】 王嘉军微生物学免疫学新进展第37卷，第4期2011【7】 周国庆，唐琴，黄丽，孙保亮泰山医学院学报，Treg的免疫磁珠提取纯化方法【8】 姜小丽，杨婷 等中国免疫学杂志2013年第四期哮喘小鼠中Foxp3+Treg/Th17的失衡及意义【9】 王建华糖尿病自我管理全书北京：北京科学出版社2010,参考文献,ALL LIKE THAT! THANKS! 希望观者能给与可行性的指导及实验过程的优化,
