1、 遗传与分子生物学实验(B模块-基因克隆与表达自主实验)第一周质粒DNA提取与浓度检测第二周质粒DNA的酶切及DNA片段从凝胶中分离第三周质粒DNA片段的胶回收与连接第四周感受态细胞的制备与DNA的转化第五周外源DNA在大肠杆菌中的高效表达公告:请在课前结合课件、相关资料及慕课视频认真自学,并完成预习报告(助教课上检查,占每次实验课成绩的50%)。课上不再讲述实验原理及实验步骤,可能会有小测检验预习情况。上课时你将亲自操作,完成相应实验内容。遇到实际问题,请向指导教师及助教咨询。目的基因 载体 体外连接重组子(杂合DNA)转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增,获得子代DNA基因克隆的技术路线目的基
2、因在原核细胞中表达 提取质粒DNA+酶切遗传与分子生物学实验(B模块-基因克隆与表达自主实验)第四周 感受态细胞的制备与DNA的转化【实验目的】1.掌握制备化学法感受态细胞的注意事项及实验操作步骤;2.掌握DNA转化的注意事项及实验操作步骤。感受态细胞的制备与DNA的转化(1)细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接受位点充分暴露)。(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNA直接穿过质膜进入细胞)。(3)受体细胞为限制修饰酶缺陷型,使转入的DNA分子不易被切除或破坏。n 感受态细胞(Competent cell)n 细胞处于能够吸收外源D
3、NA的状态称感受态,经特殊处理后处于此状态的细胞称感受态细胞。【实验原理】n E.coli DH5菌株F-,80lacZM15(lacZYA-argF),U169,end A1,recA1,hsdR17(rk-,mk-),sup E44,-,thi-1,gyrA96,relA1,phoAn 最常用来制备感受态细胞的大肠杆菌菌株 缺失核酸内切酶(endA1),提高了外源质粒DNA的产量和质量;重组酶缺陷型(recA1)减少插入片段的同源重组率,保证了外源DNA的稳定性;存在lacZM15 以及 lac lq 基因的缺失,不需加 IPTG,只需要添加 X-Gal 就可进行基于互补原理上的蓝白斑筛选
4、实验。不带有任何抗生素抗性n 感受态细胞可以用来做什么?n 将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化),不仅可以检验重组DNA是否构建成功,还可作为重组DNA的宿主进行后续实验,如蛋白质表达纯化等工作。n 常见感受态细胞的制备方法及DNA转化方法n 电击法:利用瞬时高压电流(数千伏特)处理细胞悬浮液,使细胞膜在高压电作用下发生去极化,产生微孔,溶液中的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。n 化学法:细菌处于0低渗的CaCl2溶液中,细胞膨胀成球形,待转化的DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物吸附于细胞表面。42短时间热击处理,促使细胞吸收外源DNA。n 两种方法的区别:做
5、电击转化时,悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡,但是这种方法很直接,转化效率很高。但是需要专门的仪器。化学法(CaCl2)操作简单,不需要特殊设备,转化效率足以满足一般克隆实验的需要,故使用范围非常广。n 制备化学法感受态细胞的关键步骤n 细菌要处于对数生长期(OD6000.5),用丰富培养基培养细菌、降低培养温度可进一步提高转化效率;n 诱导感受态的离子性质(除Ca2+外,可加Mn2+、K+等);n 试剂纯度要高、器皿要洁净(无盐及去污剂残留);n 操作过程中避免杂菌和杂DNA的污染。n 转化的连接反应或质粒DNA体积不应超过感受态细胞体积的15%;n 质粒DNA大小超过7.5kb后,转化效
6、率会下降;超过10kb,质粒DNA可能会在细菌增殖的过程中丢失;n 转化DNA量从0.1pg-50ng时,转化效率呈线性增加,超过50ng后不会显著增加;n 42热击时间可根据离心管的厚度、感受态细胞体积、转化质粒大小而改变,但不宜超过90秒;n 感受态细胞不能反复冻融,不能长期保存:4,不含甘油可保存1个星期;-20,含50%甘油可保存1个月;-80,含15%甘油可保存3个月。n 影响化学法感受态细胞DNA转化效率的因素n 检测感受态细胞的转化效率n 将一定量的完整质粒(如,pBluescript 或其它质粒DNA)转化到感受态细胞中,将转化后的细菌涂布到选择培养基上,根据菌落生长单位cfu
7、(colony-forming unit)/g DNA,计算感受态细胞的转化效率=菌落总数/铺板DNA的总量。n 具体做法如下:对已知浓度质粒DNA进行系列稀释(0.1 ng/l,0.5 ng/l,1.0 ng/l),取1l转化100l的感受态细胞。第二天统计四个转化细菌平板上的菌落数。如果三个DNA浓度给出的数值偏差太大,可能原因有DNA稀释浓度不准、吸液误差、转化有问题等)不含DNA的负对照平板上应该没有任何菌落。n 更多内容,详见“感受态细胞转化效率检测-B4”n 转化效率110 6 cfu/g DNA可满足普通的亚克隆实验;n 110 7 cfu/g DNA用于做更复杂的亚克隆,有限量
8、的DNA的转化,T-克隆实验;n 构建文库和突变要求用的转化效率为110 8 cfu/g DNA。n 抗生素筛选法:由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子,如受体细胞没有转入质粒,则在含Amp的培养基上不能生长,能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了质粒。质粒在菌体内扩增后,可将其提取出来,进行电泳、酶切等进一步鉴定。n 转化后重组子的筛选方法n 互补筛选法:载体含有半乳糖苷酸基因(lacZ)的调控序列和头146个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码半乳糖苷酶端氨基酸的序列。当外源基因插入时,二者溶为一体后,有半乳糖苷酶表达
9、,在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷(x-gal)培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点,从而造成插入失活,而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。n 直接DNA电泳法:利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的特性,直接从转化后的菌体克隆中分离质粒,电泳、比较其分子量来确定。4.酶切验证法:根据已知外源DNA序列的限制性酶切图谱,选择一两种内切酶切割质粒,电泳后比较电泳结果(DNA带数和长度)。或用合适的内切酶切下插入片段,再用其它酶切这个片段,电泳后比较结果是否符合预期结果。5.菌落PCR验证法:通过煮沸细菌菌落而获得
10、细菌内的DNA,再通过PCR检测是否能扩增出预期的DNA插入片段。6.质粒DNA测序法:从细菌中提取质粒DNA,对其进行测序。7.Southern印迹法:从细菌中提取DNA(或质粒载体),再和与转化外源DNA序列互补的DNA或RNA探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交,显示出杂交信号。本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。1.材料 E.coli DH5菌株,Amp;pBS质粒DNA(购买或实验室自制),1.5mL离心管。2.设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心 机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰
11、机,分光光度计,微量移液枪。3.试剂(1)LB培养液,(2)Amp储存液(50mg/mL),(3)含Amp的LB固体培养基,(4)0.1M CaCl2溶液,(5)无菌水。【实验材料】【实验分组】1.制备感受态细胞:每人制备200l化学感受态细胞。2.DNA转化:每两人2个DNA连接反应,加上1个质粒DNA转化正对照、1个无菌水负对照,共计4个转化。1.制备感受态细胞(40-45分钟);2.转化实验-感受态细胞与DNA共冰浴(30-35分钟);3.热击90秒后37恢复1小时,期间吃午饭(1小时10分);4.收集细菌,涂平板,37培养过夜(约25-30分钟)。【实验时间安排】(特别提醒:由于受体菌
12、本身不带有任何抗生素抗性,以下的步骤都要在无菌条件下进行。)(一)感受态细胞的制备(CaCl2 法)受体菌的培养:将受体菌在无Amp的LB培养板上划线,37度培养16小时,从此板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落,接种于5mL LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mL LB液体培养基中,37、300rpm培养2-3小时至OD600=0.5左右。(助教已提前准备好)注:2.0mL培养液可以制备200l感受态细胞(浓缩10倍)【实验步骤】1.将2.0mL培养液装入离心管中,冰上放置5分钟,然后于4下4000rpm离
13、心5分钟。2.弃去上清,用1mL预冷的0.1M的CaCl2 溶液轻轻悬浮起细胞。冰上放置2分钟后,4下4000rpm离心5分钟。3.弃去上清,加入1mL预冷的0.1M的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4下4000rpm离心5分钟,弃上清。4.用200uL预冷的0.1M CaCl2 悬浮细胞,即成感受态细胞悬液。在接下来的转化实验中,两个人一组,将两人制备的感受态细胞悬液合并在一起,共计400uL感受态细胞悬液,分装于4个离心管中,用于4个转化实验。注意:以下步骤务必在低温下进行!不要用手握离心管!(二)转化步骤 1.两人一组,取4个1.5mL离心管各加入100L新鲜制备的感
14、受态细胞,分别加入 a.上周DNA片段从凝胶中分离和连接实验中所获得的两个DNA连接反应(载体DNA自连/载体与插入片段连接);b.第一周质粒DNA提取与酶切实验中获得已知浓度的pBluescript质粒DNA(建议转化50ng,如果浓度高可以稀释一下),做为正对照组,用于计算转化率(=平板上菌落数/gDNA);c.10L无菌双蒸水,做为负对照组,用以检查制备感受态细胞的过程中是否有杂菌的污染。轻轻将溶液混和混匀,将离心管置于冰上30分钟。2.于42干浴器内热击处理90秒。3.冰浴2分钟。4.各加入200L LB 液体培养基(不含Amp!),混匀后37振荡培养30-60分钟,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。5.将所有培养液涂布于含Amp(100g/mL)LB固体培养基上,37培养1216小时,观察结果。【结果与分析】1.计算转化率(=平板上菌落数/gDNA)。2.根据转化率和阴性对照分析实验结果。1.根据本实验结果分析影响转化率的因素有哪些?2.尽可能多地写出重组子筛选的方法。【问题与讨论】