1、第三节 DNA的反转录合成,The central dogma of genetics (中心法则),Howard Temin,David Baltimore,Howard Temin and David Baltimore challenged the central dogma of biology by showing that the genetic informationcan back-flow from RNA to DNAthrough the action of a kind of RNA-dependent DNAploymerase called reverse tran
2、scriptase; they shared the 1975 Nobel Prize in Physiology or Medicine with another scientist for their discovery of this enzyme,反转录（reverse transcription）：是以RNA为模板，由反转录酶催化4种dNTP聚合、产生DNA的过程；又称RNA指导的DNA合成。RNA肿瘤病毒都含有反转录酶，所以将含有反转录酶的RNA病毒称为反转录病毒（retrovirus）,反转录酶的结构,兼有3种酶的活性：RNA指导的DNA聚合酶DNA指导的DNA聚合酶RNase
3、H,反转录酶（reverse transcriptase）,反转录酶由反转录病毒基因组RNA编码的，该基因组有两条相同的正链RNA分子组成；cDNA（copied DNA）是反转录最终的双链DNA产物，其长度比反转录病毒正链RNA要长，在5端多了序列U3，3端多了U5，所以在两端产生相同的长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）。,1. A Retrovirus specific cellular tRNA hybridizes with a complementary region called PBS (Primer Binding Sites),2. Reve
4、rse Transcriptase (RT) starts at this binding site and copies RNA into a single strand of complementary DNA. A DNA segment is extended from tRNA based on the sequence of the retroviral genomic RNA,3. The viral R and U5 sequencesare removed by RNase H.,LTR Long Terminal RepeatLeft LTR - Redundant seq
5、uence R+ 5 untranslated region (U5)Right LTR - Redundant sequence R+ 3 untranslated region (U3),反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径,4. First jump: DNA hybridizes with the remaining R sequence at the 3 end.,5. A DNA strand is extended from the 3 end.,6. Most viral RNA is removed by RNase H,7. A second DNA strand
6、 is extended from the viral RNA.,8. Both tRNA and the remaining viral RNA are removed by RNase H.,9. Second jump: The PBS region of the second strand hybridizes with the PBS region of the first strand.,10. Extension on both DNA strands.,反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径,RNA病毒在细胞内复制成双链cDNA。接着双链cDNA插入到细胞基因组内，形成
7、前病毒（provirus） ，在一定的条件下随宿主基因一起复制和表达。这个过程称为整合（integration）。,反转录病毒的生活周期,1. 以病毒RNA为模板，经反转录酶作用，产生负股DNA，构成由RNA：DNA中间体2. 由RNase H水解除掉亲代RNA后，由负股DNA复制正股DNA3. 双股DNA进入核内，整合到细胞染色体中形成前病毒4. 病毒活化时由DNA转录形成病毒RNA和mRNA5.在核蛋白体上转译病毒结构蛋白，再与病毒RNA装配成子代病毒6. 出芽释放,反转录病毒的生活周期,1.病毒RNA通过反转录合成双链cDNA2.双链cDNA整合入宿主DNA形成原病毒,反转录病毒的生活周
8、期,双链cDNA插入宿主DNA的整合机制,1.病毒RNA通过反转录合成双链cDNA2.双链cDNA整合入宿主DNA形成原病毒3.原病毒DNA转录产生病毒RNA,反转录病毒的生活周期,反转录病毒基因的编码产物, 典型的反转录病毒含有3个基因：gag, pol, env ; 反转录病毒的编码产物是多聚蛋白质； Gag基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）； Pol基因编码3种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶 Env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白pol蛋白的翻译需要核糖体移码；,4.病毒DNA经翻译和包装形成反转录病毒颗粒,三种蛋白质产物的每一种都可由蛋白酶加工产生出多种蛋白;,第四节 DNA损伤
9、修复,（一）引起DNA损伤的因素（二） DNA损伤修复系统的各种类型（三）DNA损伤修复的意义,DNA Repair,Mutagenic changes,Mis-incorporation,Natural (chemical or enzymatic base changes),Damagesuch asUV,Transposons(retrovirus),遗传信息的突变来源：DNA复制产生误差化学或物理损伤转座子（transposons）的转座作用,Angelina Jolie 以及家族的故事,携带缺陷基因BRCA1,The first preventive measure is proof
10、-reading,DNA损伤修复系统有多种类型,错配修复,错配修复系统（mismatch repair system）能够发现和修复DNA复制中错配的核苷酸，提高复制准确率。,错配修复系统组成： MutS MutL MutH,细菌的错配修复系统如何运作？首先，在基因组中迅速找到错配的核苷酸；然后，准确地校正错配核苷酸,错配修复系统,模板链与新链处于不同的甲基化状态,错配修复系统修复新链上的碱基,错配修复系统修复复制差错,三大因素：MutS、MutL、MutH三大步骤：起始、切除、修复,DNA损伤修复系统有多种类型,直接修复,直接修复（direct repair）系统利用酶简单地逆转DNA损伤,
11、光复活修复系统：修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。,UV,直接修复（direct repair）系统利用酶简单地逆转DNA损伤,光复活修复系统：修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。机制：细胞内光裂合酶（photolyases）分子中生色基团次甲四氢叶酸吸收光子并将FADH2激活生成的继发性FADH2，再将电子转移给嘧啶二聚体，使其还原。分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。,蓝光,光裂合酶,二聚体解聚,二聚体形成,UV,光裂合酶,直接修复（direct repair）系统修复DNA损伤的机制,DNA损伤修复系统有多种类型,碱基切除修复,Cytosine
12、Deamination,Cytosine = G,Uracil = A,deamination either chemically or enzymatically,Cytosine Deamination,5-Methyl-Cytosine = G,Thymine = A,E.Coli 碱基切除修复系统切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶,AP位点（apurinic or apyrimidinic site）,It is a step-wise, well-controlled process,碱基切除系统修复切除受损碱基,碱基切除修复（base excision repair，BER）对象：受
13、损的碱基修复系统：糖苷酶（glycosylases)识别、切除受损碱基，产生AP位点（apurinic or apyrimidinic site）。AP内切酶在AP位点的5端切断磷酸二酯键。AP外切酶再切割AP位点的3端。DNA聚合酶填补产生的缺口。DNA连接酶：连接缺口,In addition to dUMP, UNG/UDG can also recognize other abnormal bases in DNA,DNA核苷酸识别的异常碱基包括胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶氧化的鸟嘌呤（oxoG）脱氨基的腺嘌呤开环碱基碳原子之间双键变成单键的碱基等。,碱基脱落形成AP位点,热、酸和糖基化（g
14、lycosylase）的情况下,自动防故障系统,特异的DNA糖苷酶能识别oxoG（A配对，这种错配因模板链中oxoG未能修复而产生），在这种情况下，DNA糖苷酶能够识别与oxoG配对的A，视其为突变并切除之，以便代之以C。,DNA损伤修复系统有多种类型,核苷酸切除修复,核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）系统并不识别任何特殊的碱基损伤，而是识别DNA双螺旋形状的变形。,E.Coli的核苷酸切除修复系统主要由4种蛋白质组成：UvrA、UvrB、UvrC和UvrD,UvrA识别DNA双螺旋结构变形UvrB负责解链，募集核酸内切酶UvrCUvrC在损伤部位
15、的两侧切断DNA链UvrD去除这两个切点之间的DNA片段DNA聚合酶I填补DNA连接酶连接缺口,核苷酸切除修复系统,着色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）,与核苷酸切除修复系统相关的疾病,核苷酸切除修复系统不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救转录模板链损伤、暂停转录的RNA聚合酶，即转录偶联修复（transcription-coupled repair）。作用方式：NER蛋白质被募集于暂停的RNA聚合酶。转录偶联修复的意义：将修复酶集中于正在转录DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。RNA聚合酶起到损伤传感蛋白的作用！,真核转录偶联修复的核心是TFIIH。TFII
16、H分别参与两个独立过程：1.在核苷酸切除修复（包括转录偶联修复）时起DNA解旋酶的作用；2.在转录过程中打开DNA模板。,DNA损伤修复系统有多种类型,重组修复,重组修复系统能够修复双链断裂损伤对于DNA双链断裂（double-strand break，DSB）损伤 ，细胞采用双链断裂修复，即重组修复（recombinational repair），通过与姐妹染色体正常拷贝的同源重组来恢复正确的遗传信息。,在重组早期发挥作用的一组酶细菌的rec基因（recA、recB、recC和recD）重组修复作用机制：RecBCD酶的活性包括核酸酶活性可降解DNA；解旋酶活性，在SSB存在时它可解开双链；
17、ATPase活性。RecBCD酶的倾向位点为chi 序列（5GCTGGTGG3),可在其附近将单链DNA切断，从而DNA重组成为可能。,细菌的重组修复机制,recBCD酶，它利用ATP水解提供能量沿着DNA运动。2. 识别chi序列，在距chi位点3端4-6bp处切开3侧的一条单链DNA,细菌的重组修复机制,3.RecA结合到单链3端，使带有3末端的单链释放出来。,细菌的重组修复机制,4. RecA识别并指导单链DNA 入侵同源区,形成异源双链区。,DNA损伤修复系统有多种类型,跨损伤DNA合成,跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNA,正在复制的DNA聚合酶可能遭遇尚未修复的DNA损伤，
18、细胞自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位，这一机制就是跨损伤DNA合成（translesion DNA synthesis）。E.Coli 跨损伤DNA合成由UmuC-UmuD复合物进行。,有时候叫error-prone or SOS 修复,跨损伤DNA合成原理,SOS修复反应受RecA-lexA系统的调控,DNA损伤修复的生物学意义,在没有DNA修复系统作用时，DNA复制错配发生率高达1/2001/100。完好的修复系统使错配率降至10-1110-10。,极少数不能修复的DNA损伤将会导致基因的突变，其中一部分突变对人类而言是有其积极的意义的。,突变是进化的分子基础从生物进化史看，进化过程
19、是突变不断发生所造成的，突变为今后提供了最根本、最原始的材料，没有突变就不可能有现今五彩缤纷的生物世界。动植物及微生物中很多单位形状内的差别，都来自该生物进化过程中的基因突变。,而另一部分突变是某些疾病（尤其是癌症）的发病原因。这些疾病包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的疾病，一般人认为突变有害，指的就是这种类型的突变。,修复的存在保证了物种遗传的稳定性，对降低修复缺陷相关疾病的发病率有着重要的意义！,已知几种家族性癌症是由DNA修复的遗传缺陷引起的。,日本长崎、广岛原子弹爆炸,第五节 DNA重组DNA Recombination,意义：是基因变异和物种演变 、生物进化的基础。包括：同源重组、特异位
20、点重组和转座重组,1. 同源重组的定义(homologous recombination，HR)：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。又称 基本重组（general recombination）。,一、同源重组,2. 同源重组的特点,同源重组不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或类似性。要求较大的同源DNA片段（75bp)才能进行交换。同源重组(homologous recombination)广泛存在于生物界。如真核生物姊妹染色单体的交换；细菌及某些低等真核生物的转化；细菌的转导，DNA损伤重组修复等。,3.同
21、源重组的Holliday模型,1.两个同源染色体DNA排列整齐；2. 两个DNA分子各有一条链断裂；3. 两断裂链交换准备重接；4.断裂点相互连接；5.形成交联桥；,6.交联桥移动；7.形成Holliday中间体；8.Holliday中间体发生空间异构9.形成Holliday异构体,10.Holliday结构从中间切开11.修复切口12.形成双链重组体DNA。,电镜下的Holliday中间体,在重组早期发挥作用的一组酶细菌的rec基因（recA、recB、recC和recD）1. RecBCD复合物：具有3种酶活性,依赖于ATP的核酸外切酶，可被ATP增强的核酸内切酶以及需要ATP的解螺旋酶。
22、2. CHI位点（5GCTGGTGG3）,4.细菌同源重组的机制,3. RecA蛋白：可结合单链DNA、形成RecA-ssDNA复合物得以入侵同源区。,在重组后期发挥功能的一组酶：RuvA识别Holliday结构连接处RuvB：具有解旋酶和ATPase活性，能驱动分支移位。,RuvC：是编码专一识别Holliday连结体的一种内切核酸酶。,5,二、特异位点重组,定义：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称位点特异的重组（site specific recombination）。,例子：1. l噬菌体DNA的整合,l噬菌体形态及DNA结构,lDNA是双链的DNA分子,在双链分子的
23、5末端比3末端多12个碱基。两个单链末端区域（粘性末端）的碱基顺序是彼此互补的。因此通过这两个单链末端形成碱基对，线性DNA分子可以环化，产生含有两个单链缺口的不闭合环。在此环化过程中，新形成的双链区中不缺失任何碱基，DNA连接酶可将其转变为共价的闭合环。,l噬菌体溶源生长和溶菌生长：,在溶菌状态下lDNA在宿主细胞中以环状分子独立存在，而在溶源状态时噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分，称为原噬菌体。 这两状态的转换都与位点专一性重组有关，要进入到溶源状态，游离的lDNA必须整合到宿主DNA中去，为了从溶源状态过渡到溶菌状态，噬菌体DNA必须从细菌染色体上切除下来。 整合和切除过程是在细菌和噬
24、菌体DNA转移的附着位点上进行的。,l噬菌体DNA编码的l整合酶（integrase）能指导噬菌体DNA插入E.coli 染色体中,l整合酶（integrase）,l噬菌体DNA和宿主DNA上都有一小段同源序列，称为附着点(att，attachment site)。催化整合时，整合酶就结合在两个靠在一起的附着点上。,l整合酶的作用位点,整合作用宿主因子(IHF, integration host factor),二、特异位点重组,定义：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称位点特异的重组（site specific recombination）。,例子：l噬菌体DNA的整合细菌
25、的特异位点重组,鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种：H1和H2沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1和H2的交迭表达。但是，在单菌落的沙门氏菌中经常出现少数成另一H抗原的细菌，这种现象称为鞭毛相转变。,鼠伤寒沙门杆菌的特异位点重组,H片段的结构包括：特异重组位点（hix）两个启动子（P）编码倒位酶Hin的hin基因,鼠伤寒沙门杆菌H片段的组成和结构,沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变,Hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组（倒位）。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一个正向时驱动H2和rH1基因表达，反向（倒位）时H2和rH1不表达。r
26、H1为H1阻遏蛋白基因。,二、特异位点重组,定义：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称位点特异的重组（site specific recombination）。,例子：l噬菌体DNA的整合细菌的特异位点重组免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白是指具有与抗原决定簇特异性结合的许许多多球蛋白分子的总称。因为抗原的种类极多，每种抗原上有不同的抗原决定簇。而人类基因组中编码免疫球蛋白的基因数目却远远低于抗原的数目 。研究发现，不同免疫球蛋白的数量如此庞大是由于基因重排的结果。,IgG结构,免疫球蛋白的基因库,k基因库（k链基因连锁群）第2号染色体l基因库（l链基因连锁群）第22号染色体3
27、. H基因库（重链基因连锁群）第14号染色体(重链)。,轻链,决定轻链的基因组： L、V、J、C决定重链的基因组：L、V、D、J、CL：前导片段（leader segment）；V：可变片段（variable segment）J：连接片段（joining segment）；C：恒定片段（constant segment）D：多样性片段（diversity segment）,重链基因结构更为复杂，编码可变区的基因片段除V、J和C基因片段外，还有D基因片段。D片段位于V和J之间，与抗体的多样性有关，故称D基因。,重链（IgH）基因的V-D-J重排和轻链（IgL）基因的V-J重排均发生在特异位点上。
28、在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列（recombination signal sequence，RSS）。此重排的重组酶基因rag（recombination activating gene）共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。,轻链基因的重排与表达,重链基因重排与表达,三、转座重组,转座子的发现者：Barbara McClintock，获1983年诺贝尔生理医学奖。,转座重组定义：是插入序列和转座子介导的基因移位或重排。,大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入系列（insertion
29、 sequence）和复合转座子（transposons， Tn）。由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座（transposition），又称转座重组（transpositional recombination）,（一）转座子的分类和结构特征,在原核生物中已发现两种类型的转座子，简单转座子和复合转座子。简单转座子又称为插入序列（IS），又称IS元件。复合转座子也称Tn元件。 典型的转座子一般都含有2部分序列:(1)含有编码促进转座的转座酶的基因，这种酶催化转座子插入到另一个位点；（2）在转座子的两端含20-40bp的反向重复序列，称为末端反向重复序列（IR）。IR中有转座酶识别并能特异
30、性结合的位点。,（1）插入序列,插入序列（insertion sequences， IS）的组成：二个分离的反向重复（inverted repeats， IR）序列一个转座酶（transposase）编码基因：表达产物可引起转座。,特点：（1）IR中有转座酶识别并能特异性结合的位点。（2）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3-9bp),（2）复合转座子,复合转座子（transposons）：复合转座子是一类较大的转座因子，通常以Tn 表示。复合转座子组成：长末端反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因,（二）转座子的转座机制,转座作用的过程1.转座酶识别转座子末端反向重复序列并在
31、3端切开，同时在受体分子靶部位交错切开单链。2.靶位点突出5末端与转座子3端相连，形成交叉结构，称为转座共同中间体；3.DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶封闭切口。,交错末端的产生与填补说明了靶DNA在插入位点存在正向重复，两条链上切口之间的交错取决于正向重复的长度，因此，每个转座子所特有的靶重复序列，反映了切割靶DNA的酶的几何形状。,（三）转座作用机制的类型,复制型转座：在转座反应过程中，转座的元件被复制，一个拷贝仍留在原位置上，而另一个则插入到新部位，这样转座过程伴随着转座子拷贝数的增加。保守型转座：转座子直接从供体的一个位点迁移移到受体的新位点处。,复制型转座：在转座反应过程中，转座的
32、元件被复制，一个拷贝仍留在原位置上，而另一个则插入到新部位，这样转座过程伴随着转座子拷贝数的增加。保守型转座：转座子直接从供体的一个位点迁移移到受体的新位点处。,复制型转座：在转座反应过程中，转座的元件被复制，一个拷贝仍留在原位置上，而另一个则插入到新部位，这样转座过程伴随着转座子拷贝数的增加。保守型转座：转座子直接从供体的一个位点迁移移到受体的新位点处。,复制型转座,保守型转座,细菌的可流动性元件,玉米基因中的转座子Ac-Ds系统,玉米糊粉层颜色的控制涉及多对相关基因，当C基因为野生型时，胚乳呈紫色；若C基因的突变阻断了紫色素的合成，那么胚乳为白色，在胚乳发育过程中，若突变发生回复则导致产生
33、斑点，回复突变发生得越早，产生的紫斑就越大，发生得越晚，则产生的紫斑就越小。,突变基因C是由一个“可移动的控制因子”引起的，称为Ds，即解离因子。它可以插入到C基因中，另一个可移动的控制因子是Ac，称激活因子，它的存在激活Ds转座进入C基因或其它基因，也能使Ds从基因中转出，使突变基因回复，这就是Ac-Ds系统。,玉米基因中的转座子Ac-Ds系统,2018/7/11,110,结合医学问题，说明DNA复制错误/损伤/修复的生物学意义举例说明PCNA作为指标的意义,前导链 后随链 复制子 冈崎片段 半保留复制 半不连续复制 端粒酶 反转录酶,第十六章复习要点,概念,论述题,概述题,原核生物DNA复制的基本过程线粒体/噬菌体DNA复制的方式真核生物DNA复制的特征DNA重组的主要类型,
