1、基因诊断与测序技术在其中的应用,武汉分子生物学实验室 陈然2015-03-20,内容,基因诊断的概念,内容-1,基因诊断基因预测,基因检测,基因预测,基因诊断,即分子诊断，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化等而做出的或辅助临床诊断的技术。,又称基因体检，通过检测基因判断未来患某种疾病的可能性（风险预测），进而加强健康管理。,基因诊断基因治疗,基因诊断的概念,正常人不会发生融合基因或基因突变。某些疾病的患者会检测出融合基因或基因突变。,分子实验室开展的诊断类检测-1,正常人和某些疾病的患者间基因表达量不同。,正常人之间的基因分型不同。,分子实验室开展的诊断类检测-2,基
2、因测序技术及发展沿革,内容-2,DNA测序技术，即基因测序技术，是指测定DNA碱基序列的技术。人类基因组约有30亿个碱基对。大部分DNA测序的目的是得到特定基因的特定区域上序列信息A、T、G、C四种碱基的排列顺序，即靶向基因测序/目标区域测序。通过对比被检者的碱基排列顺序是否与正常人一致，以此作为疾病诊断的依据。测序技术已广泛应用在医学、生物学研究，各类疾病的检测和筛查，物种鉴定，农作物筛选，基因工程,基因测序技术,为什么使用测序技术进行诊断,既能检测已知突变、也能检测未知突变。,二代测序技术的发展使得基因诊断的深度和广度得到极大扩展，使得多基因参与的复杂疾病检测，及高灵敏度检测成为可能。,能
3、够检测一段区域内的所有点突变。具备成本和可操作性上的优势。,Thermo Life/ABI3500xL,Beckman CoulterGenomeLab GeXP,Roche/454Genome Sequenser FLX,Illunima HiSeq 2500,Life/Ion TorrentPGM,PacBio RS System,一代测序,二代测序,三代测序,1977起,2005起,2011起,Thermo Life/ABISolid 5500,测序技术的发展,三代测序技术的比较,一代测序及片段分析检测流程,内容-3,一代测序检测流程,医院,前处理录入Lis系统,分子实验室分拣、登记,物
4、流,标本（血液）,DNA,RNA,提取核酸过程,标本收取&处理,PCR：Polymerase Chain Reaction（聚合酶链式反应）的简称。PCR是一个在体外特异性的复制一段DNA片段的过程。1985年由美国科学家Mullis发明。分子生物学最常用的体外扩增DNA的方法，使人们很快的获得大量拷贝的特异DNA片段，利于继续进行后续检测的分析。,DNA模板；4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP ）；耐热性聚合酶(如Taq)；一对特异性引物；适量的反应缓冲液；,基因扩增仪（PCR仪）,PCR扩展目的基因片段,1个PCR循环包括变性、退火、延伸3步重复13
5、步30-35轮,目的DNA片段扩增百万至亿倍以上，能够被电泳等后续方法检测到。,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR程序,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮循环结束,第2轮循环开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,56,72,95,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮循环结束,第3
6、轮、第4轮,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,经多次循环后靶片段扩增的数量,SAP：Shrimp Alkaline Phosphatase，虾碱性磷酸酶，催化降解体系里多余的dNTP。Exo I： Exonuclease I，核酸外切酶I，催化分解体系里多余的单链DNA（即引物）。同时向PCR产物中加入一定的SAP和Exo I，去除多余的dNTP和引物，只保留扩增产物，达到纯化的效果。,酶解消化,Frederick Sanger, 1918-2013。1958年和
7、1980年诺贝尔化学奖得主。1977年提出双脱氧末端终止法。,在反应体系中加入已经过酶解消化的PCR产物、耐热性聚合酶、4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、4种带荧光标记的双脱氧单核苷酸ddNTP（包括 ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP ）、单条特异性引物、适量的缓冲液。,测序反应：双脱氧末端终止法（Sanger法）,# 由于双脱氧单核苷酸缺乏延伸所需要的3-OH基团，一旦掺入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。# 每当DNA聚合酶需要dNTP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是掺入ddNTP，结果导致DNA链延长的终止；二
8、是掺入dNTP，使DNA链仍可继续延长，直至掺入下一个ddNTP。# 根据这一方法，就可得到一组长短不一的链终止产物，彼此只相差一个碱基。它们有共同的起始点，但终止在不同的荧光标记的ddNTP上。# 通过高分辨电泳对这一组产物进行分离，光学系统捕捉到ddNTP的荧光信号，以峰的形式展现成图谱，并按顺序排列。从电泳图谱上可读得DNA碱基序列。,测序反应：双脱氧末端终止法（Sanger法）-2,测序反应产物纯化目的：去除多余荧光ddNTP对激光检测器的干扰；方法：乙醇沉淀法。加入Hi-Di甲酰胺并变性：将DNA双链打开，维持其处于单链状态。,测序反应产物纯化及变性,基因分析仪工作原理,基因分析仪是
9、进行毛细管电泳的仪器，而不是测序反应发生的场所。,毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）：以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳的分辨率比PAGE电泳更高，能够分辨出1个碱基的DNA片段差异。经双脱氧末端终止法扩增出来的以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段通过毛细管电泳分离，再经激光系统对ddNTP上的荧光信号检测，就能得到DNA的序列信息。,基因分析仪上机,参考序列,样本序列,报出与参考序列不一致的地方,测序结果分析,毛细管电泳,分离Sanger法测序产物 一代测序,分
10、离PCR产物 片段分析,片段分析（Fragment Analysis）：用带荧光标记的引物扩增目的DNA片段（可实现多重扩增），产物经毛细管电泳分离后得到荧光峰图谱，再经软件处理得出产物的片段大小，从而得到基因型等结果。,基因分析仪不仅仅用于测序,测序：检测DNA片段中的碱基序列。,片段分析：分离荧光标记的片段并检测其大小。,流程短；灵敏度高；多重扩增增加了检测通量；应用及衍生技术多；不能检测点突变，不能检测未知突变。,测序vs片段分析,片段分析的应用,片段分析的检测流程,PCR上样准备上机,片段结果示例,MLPA： Multiplex Ligation-dependent Probe Amp
11、lification（多重连接依赖式探针扩增）的简称，由MRC-Holland公司于2002年首创。该技术利用杂交、连接和PCR扩增反应三个基本步骤，在单个反应管内可进行最高达50种的核苷酸片段相对定量检测。优势：通量高；灵敏度高；操作简单；特别适于检测DNA缺失/重复突变（Indel），CNV（Copy Number Variation）突变。局限：不能用于检测STR（短串联重复序列多态性）；不能用于检测染色体平衡易位；不能用于单个细胞检测；开发新MLPA试剂盒很困难；只集中于人DNA分析；,定量PCR不能达到,Southern Blot费时费力,测序不能检测中大片段Indel和CNV,ML
12、PA技术,MLPA技术流程,缺失突变,CNV突变,MLPA举例,MLPA的量化结果,ThermoFisher Scientific Life TechnologiesIon Torrent二代测序平台,内容-4.1,Ion Torrent公司简介,Ion Torrent公司，由Dr.Jonathan Rothberg创办。,创立454生命科学公司，推出第一台NGS测序仪。,2007年以1.4亿美元被罗氏公司收购。,创立Ion Torrent公司，推出第一台半导体测序仪PGM。,2010年以3.5亿美元被Life Technologies收购。,创立RainDance公司，开拓出第三代PCR数字
13、PCR技术。,Ion Torrent半导体测序技术的特点-1,成本低：设备价格实惠，无光学系统。通量灵活：选择合适的芯片，无论样本多少都能开机。小型化：为临床检测而设计的台式测序仪，改变了NGS的发展方向。快速性：无荧光检测，测序步骤耗时短。,Ion PGM首款半导体测序仪，全球销售速度、普及速度最快的测序仪。,Ion Torrent半导体测序技术的原理,Ion Torrent半导体测序核心技术,Ion Torrent技术流程,文库制备手工完成,模板制备手工完成,上机测序自动化完成,数据分析自动化完成,核酸提取,PCR扩增目的片段,文库制备的目的,模板制备的目的,使ISP珠子上富集同一克隆的D
14、NA片段。,芯片上样和测序仪测序,PGM的清洗 PGM的初始化 模板上芯片-ISP 珠子的Loading,PGM测序结果,数据分析,通过专用服务器的插件分析。插件平台开放，便于升级、共享。,VariantCaller插件分析结果,Illumina二代测序平台,内容-4.2,Illumina 公司，成立于1998年，原专注于BeadArray芯片分型技术。2006年收购Solexa，不断改良Genome Analyzer NGS平台，目前成为高通量测序的行业领导者。,Illumina公司简介,Illumina二代测序技术特点,准确性高：唯一在Q30上表现出色的二代测序平台。世界上第一台获得FDA
15、认证的测序平台。数据产出量巨大：大规模样本一起测序时，每样本平摊成本低。市场占有率高：众多科研文章均是基于Illumina平台发表。集成自动化：Miseq可承担簇生成、测序与数据分析。,Illumina二代测序核心技术,Sequencing By Synthesis (SBS, 边合成边测序 ),Illumina二代测序技术流程-1,Illumina二代测序技术流程-2,决定了测序通量,Illumina二代测序技术流程-3,手工完成自动完成自动完成自动完成,Illumina二代测序平台的分工,Vcf.out数据结果,测序结果的分类测序策略的选择,内容-5,测序结果报告&注释-致病性突变,测序结
16、果报告&注释-可能致病性/增加风险,测序结果报告&注释-临床意义不明确,测序结果报告&注释-多态性位点，无致病性,已推出的遗传病测序检测项目-1,已推出的遗传病测序检测项目-2,已推出的遗传病测序检测项目-3,测序策略的选择,* PCR扩增多孔后，合并产物建库。* 定制Panel建库试剂盒。* 购买成品Panel建库试剂盒。,测序技术的局限性,内容-6,运用测序技术进行诊断的局限,无法测出中大片段插入/缺失突变。无法测序多重复序列。,着重于细微，不着重于全局。,步骤复杂，控制环节多。,大量数据解读是瓶颈。,国内的行业监管水平落后于国外，远落后于技术发展水平。政策制订存在风险，行业发展存在变数。,疾病,遗传性疾病,已明确致病病因的遗传性疾病,康圣环球开展的临床项目,吾生也有涯，而知也无涯。,基因诊断不是万能的。,我们面临的知识边界,武汉分子生物学实验室测序组,人员：21人，其中研究生7人。,主要设备：一代测序仪（5台）3730两台、3500xL两台、3130一台。二代测序仪（4台）PGM一台、Proton一台、Miseq一台、Hiseq 2500一台。,项目：300项。,谢 谢！,
