1、,第八章 临床分子生物学实验诊断,李士军Tel：15840688980 e-mail: 大连医科大学附属第一临床学院 实验诊断学教研室,2,第一节 基因诊断,一、常用分子生物学诊断技术1、聚合酶链反应（PCR）2、DNA测序3、荧光原位杂交技术（FISH）4、DNA印迹技术 5、基因芯片6、基因突变分析,3,聚合酶链反应PCR原理,PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性退火引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。,4
2、,PCR的基本原理,5,目的基因扩增,循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10亿),1 循环= 2 扩增子,2 循环 = 4 扩增子,3 循环 = 8 扩增子,4 循环 = 16 扩增子,5 循环 = 32 扩增子,6 循环 = 64 扩增子,7 循环 = 128 扩增子,6,7,PCR扩增仪的分类与结构,8,实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RQ-PCR）,在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而
3、实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。,定量PCR,终点定量PCR,实时荧光定量PCR,9,终点定量PCR,10,什么是Ct值?,PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 。 （C代表Cycle，t代表threshold。）,11,同一个样本重复96次PCR的扩增曲线,12,根据荧光阈值确定Ct值,荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-15,13,Ct与起始模板拷贝数的对数成线性关系,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系
4、，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,14,标准曲线的制作： 标准品,DNA样品,RNA样品,基因组DNA,PCR产物,质粒,基因组RNA,体外转录RNA,PCR 产物,质粒,15,标准曲线制作,以不同浓度梯度标准品Ct 值对其初始拷贝数对数作图,即得标准曲线。,16,ABI 7500荧光定量PCR仪,MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪,Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪,17,Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪,Light CycleTM荧光定量PCR仪,18
5、,理想的PCR实验室设置A,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,19,1,2,3,4,20,PCR技术的应用,一、感染性疾病的分子诊断和研究二、遗传性疾病的分子诊断和研究三、恶性肿瘤的分子诊断和研究四、PCR扩增仪在移植配型上的应用五、PCR扩增仪在法医学上的应用六、PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用,21,基因芯片技术,概念： 将几百至数数十万个cDNA或寡核苷酸密集排列在1cm2的芯片上作为探针，与样品荧光标记的样品DNA进行杂交，通过扫描对杂交结果进行分析。临床应用：1、优生优育2、疾病诊断3、器官移植4、病原体诊断5、法医鉴定,22,23,DNA芯片双色荧光分析,24,芯片各位点的不同发光强度,25,Thank you for your attention ！,
