1、植物组织培养技术 培养基的配制与灭菌 一、 培养基配制 正确地理解培养基的表达式是至关重要的 。 完全培养基 ： “MS+6-BA2 mg/L +NAA 0.1mg/L+蔗糖 3%+琼脂 0.65%， pH5.8”时。 表示的含义 : 基本培养基为 MS，每升培养基中添加 6-BA的量为 2 mg、 NAA的量为 0.1mg、蔗糖的量为 30g、琼脂的量为 6.5g， pH调至5.8。 培养基配制的具体步方法 1.取出母液并按顺序放好，并将有机营养物质母液溶化待用。将洁净的各种玻璃器皿如量筒、烧杯、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置。 2.取一只大烧杯，放入配制培养基总量的2/3左右纯水，依
2、照 各种母液所需的量按顺序加入，并不断搅拌。 3.加入蔗糖和琼脂，并加热使其完全溶解。 培养基配制的具体步方法 4.加入植物生长调节剂母液，注意只能添加可通过高压灭菌的生长调节剂，用纯水定容至培养基配制的量。 5.调节 pH，用 1摩尔每升氢氧化钠或盐酸进行调整至设定值 ,若培养基配制的量较少时，可用 0.1摩尔每升的氢氧化钠或盐酸调节 pH。 6.将培养基分装到培养器皿中，封好瓶口。 二、 培养基灭菌 培养基灭菌常用的有高压蒸汽灭菌法和过滤除菌法两种。 1. 高压蒸汽灭菌法 配制好的培养基可以在分装到小的培养容器中或者先不进行分装，直接盛装在较大容器内进行灭菌，灭菌方法与器具的高压蒸汽灭菌基
3、本相同，但灭菌时间与需要灭菌的培养基量密切相关 。 多数情况下，培养基高压灭菌 20分钟可以满足要求。 已分装好的培养基灭菌结束后，将培养容器取出平放试验台，待培养基凝固即可。 未分装的培养基灭菌后，应在无菌条件下，如在超净工作台中，再分装到无菌培养器皿中 。 2.过滤除菌法 培养基中如果包含有热不稳定的成分 ， 如吲哚乙酸、赤霉素、尿素等，需要用细菌过滤器过滤除菌。 为两种情况： 一是培养基全部过滤除菌，这种方法只适用于不含琼脂的液体培养基； 二是将热不稳定的成分单独溶解，经过滤除菌后，添加到经过高压蒸汽灭菌后的培养基中去。 注意： 需要过滤灭菌的溶液 pH与培养基最终 pH应当相同； 在过
4、滤之前所有成分应当完全溶解； 在添加需过滤除菌的成分时，经过高压蒸汽灭菌那部分培养基的温度应当尽可能地低，对液体培养基来说降至室温比较合适，对琼脂固体培养基来说降到 50 比较合适。 常用的过滤膜是硝酸纤维素滤膜，孔尺寸为 0.45m和 0.22m，这个尺寸能够除去溶液中微生物污染物，同时液体相对容易流过。为防止滤膜被阻塞，可以先用孔径0.45m的滤膜过滤，然后再用 0.22m的滤膜过滤。 注意事项 灭菌后的培养基应尽快地使其冷却，一般不要立即使用，放置 3d后，若没有出现真菌、细菌污染，才可使用。否则由于灭菌不彻底或封口材料的破损等原因，造成培养材料的损失。 暂时不用的培养基最好贮存于 4 5 低温下，洁净、无灰尘、遮光的地方贮存。 含吲哚乙酸和赤霉素等的培养基应在配制 1周内使用完，其他培养基也应在 2周内使用完，以免干燥变质。
