1、第十四章 分子标记辅助选择育种,作物育种：创造变异，选择优良变异传统育种选择方法：根据植株的表现型选择缺点：依靠育种家经验；育种年限长；受环境条件影响大（如抗病、抗虫等）通过与目标性状的基因连锁的、易于识别的性状作为标记，对目标性状进行间接选择（相关选择）,第一节分子标记辅助选择的意义,遗传标记：可遗传的、特殊的、易于识别的表现形式遗传标记类型：形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记分子标记：直接反应基因组间DNA差异的遗传标记分子标记辅助选择：通过与目标性状的基因紧密连锁的分子标记来判断控制目标性状的基因是否存在优点：不需要考虑作物生长条件和环境条件；减少基因互作干扰；快速垒集目标基因，加
2、快育种进程；减少群体种植规模等,简称RFLP标记,第二节分子标记的类型及原理,一、分子标记的类型,1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术,（in situ hybridization）,限制性片段长度多态性标记,（Restriction fragment length polymorphisms）,可变数目串联重复序列标记,（Variable number of tandem repeats）,简称VNTR标记,原位杂交,简称ISH,2、基于PCR的DNA标记,1）单引物PCR标记,2）双引物选择性扩增的PCR标记,3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。,限制性酶切片段的选择
3、性扩增,3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记,分为两类,PCR扩增片段的限制性酶切,如AFLP,如CAPs,Single nucleotide polymorphism，,4、基于单核苷多态性的DNA标记,单核苷酸多态性,简称SNP,用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。,二、主要分子标记,1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）,限制性片段长度多态性,1980，Bostein,碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切位点的
4、增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化,基因组DNA序列上的变化,（1）RFLP标记的原理,（2）RFLP标记的分析步骤,（3）RFLP标记的特点,优点,数目几乎无限,共显性,可以利用现有探针，具有种族特异性,RFLP标记遍及全基因组,重复性好,缺点,成本较高;,需要许多克隆探针；,一个探针只能产生一个多态位点；,所需DNA量大(515g)；,易造成环境污染,随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（ 10个核苷酸）。,通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。,2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）,随机扩增多态性DNA
5、,1990,Williams,特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。,PCR，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,Mullis等(1985),PCR反应：变性、复性、延伸。,RAPD与经典的PCR反应的区别,引物,反应条件,扩增产物,（2）RAPD标记的特点,优点,1）可检测未知序列的基因组DNA,2）引物无种族特异性,3）RAPD技术简单,4）单个引物可产生几个多态位点,5）通过克隆测序可转化成SCAR,SCAR（Sequence Characterized Amplification Region）,特异序列扩增区域标记,缺点,1）再现性差,2）显性遗
6、传,3）存在共迁移问题,3、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）,扩增片段长度多态性,1993， Zabeau marc和Vos pieter,是对限制性酶切片段的选择性扩增,（1）AFLP标记的原理,基因组的DNA进行双酶切,人工接头连接,PCR反应的引物,凝胶电泳,AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。,限制性酶,酶切频率较高的限制性酶（frequent cutter），,酶切频率较低的限制性酶（rare cutter）,产生易于扩增基因组DNA,限制扩增模板DNA片段的数量,3）选择扩增,AFLP分析的基
7、本步骤,1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA,2）DNA片段两端连接上特定的接头,(oligonucleotide adapters),6） 自显影,4）聚丙烯酰胺凝胶电泳,5）凝胶转移，干胶处理,荧光标记、银染,（2）AFLP标记的特点,优点,1）数目和种类很多,2）一次PCR反应可检测多个遗传位点,3）AFLP分析模板用量少,4）分辨率高,5）假阳性低，可靠性高,6）AFLP标记多数为显性,缺点,分析成本高,DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高,甲基化敏感酶易产生假假阳性,(Variable number tandem repeat),4、SSR（Simple Sequence Repeat
8、）,1987，Nakamura,生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列,可变数目串联重复序列,简称VNTR,小卫星（minisatellites）,微卫星（microsatellites）,简单重复序列，又称微卫星DNA,一类由16个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列,如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）n,n代表重复次数，其大小在1060之间,微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列,（1）SSR标记的原理,根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。,2）检测一
9、个单一的多等位基因位点。,（2）SSR标记的特点,1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高,3）多数为共显性标记,使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。,4）重复性高，稳定可靠,5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻,引物设计采用24个核苷酸序列为基序（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基,Inter-simple sequence repeat polymorphic DNA,ISSR标记,相邻SSR区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列,共显性遗传,5、SCAR（Sequence Characterized Amplification Regio
10、n）,特异序列扩增区域标记,一般步骤,RAPD分析,克隆片段两端测序,设计长为1824bp的引物,PCR扩增检测,高的重复性,优点,6、CAPS（Cleaved Amplification Polymorphism Sequence-tagged Site）,切割扩增多态序列标签位点技术,又称PCR-RFLP,基本步骤,特定引物PCR扩增,PCR扩增产物限制性内切酶酶切,酶切产物凝胶电泳检测,CAPs标记的优点,引物与限制酶组合非常多, CAPS标记呈共显性,所需DNA量极少,结果稳定可靠,操作简便、快捷,指基因组中长度为200500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一
11、扩增出来。,7、STS（Sequence-tagged Sites）,序列标签位点,简称序标位,YAC或cosmid插入末端序列,引物来源,RFLP单拷贝的探针序列,微卫星序列,表达基因序列,很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。,8、表达序列标签（Expressed sequence tags ，ESTs ）,表达基因的部分序列,共显性遗传,突出优点,扩增基因开发阅读框（open reading frames, ORFs）。,引物17-18个碱基，包括13-14个碱基的核心区域（5的10-11个碱基为填充区，随后正向为CCGG，反向为AATT），核
12、心区域后为3个选择碱基。,9、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）,相关序列扩增多态性,SRAP的特点,优点,1）每一反应可得大量多态位点,2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；,3）便利、简单；,4）重复性好；,5）PCR产物可直接测序。,基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。,一般通过对PCR产物、基因组文库、表达序列标签（EST）文库测序而获得,10、SNP（simple nucleotide polymorphisms）,单核苷酸多态性,等位基因遗传密码的单碱基差异。,特点：数量大,A Chromosome Map of
13、 Tomato,第三节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选,一、遗传图谱的构建,1、作图群体的建立,（1）亲本的选配,亲本选择的原则,亲本间的DNA多态性丰富；,亲本纯度高；,杂交后代可育。,（2）群体的类型,F1,P1,P2,F2,F2群体,BC1群体,RIL群体是杂交后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采用单粒的方法建立。常自交6-7代。,重组近交系群体,（recombinant inbred lines ，RIL ）,DH群体,单倍体经过染色体加倍形成的二倍体,一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异的株系,近等基因系群体,（Near-isogeneic linesN
14、IL）,拟测交（Pseudo-testcross）群体,复合杂交群体（ CP群体）,（3）群体的大小,构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。,连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。,重组率可用来表示遗传图距，,重组型配子的最大比例为50% ，变化0-50%。,图距单位用厘摩（centi-Mergan, cM） 表示，,1cM的大小大致符合1%的重组率。,2、图谱构建的理论基础,两位点存在连锁(r0.5)的概率与不连锁的概率(r=0.5)比,为确定两位点之间存在连锁，一般要求似然比大于1000，即LOD3；而否定连锁的存在，则要求似然比小于100，即LOD2。,图谱制作的统计学原理
15、,两点测验,L(r)/ L(0.5),概率之比可用似然比统计量来表示,似然函数L(),多点测验,检测作图群体的个体（株系）的分子标记基因型,P1 P2 F1,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22,B H A A H H A H B A A H H H A B H A B A H H,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,3、标记基因型检测,4、图谱构建软件,利用DNA标记数据，通过作图软件构建连锁图谱。,MAPMKER/EXE3.0,Map manger QTX20,Joinmap,陆地棉（渝棉1号T5
16、86）F2:7群体,1、质量性状的基因定位,二、 基因定位,（1）近等基因系分析,（2）分离群体分组混合分析,1,1,1,170,1,2,135,1,3,1480,1,4,215,1,5,710,CMS育性恢复基因的分子标记,控制数量性状的基因,2、 数量性状的基因定位,数量性状的基因座,（quantitative trait loci , QTL ）,检验同一标记不同基因型间数量性状均值的差异,（1） QTL定位方法,1）基于标记的分析方法,均值差检测法,若差异显著，则表明标记与QTL连锁。,陆地棉（渝棉1号T586）F2:7群体QTL定位,2）基于性状的分析方法,分离群体分群分析法,选择性
17、基因型分析法,3、QTL定位软件,Mapmaker/QTL1.0,Map Manager QTX,QTL Cartographer,MapQTL,Windows Cartographer,4、QTL精细定位1）单个QTL的精细定位,连续用渝棉1号回交分子标记辅助选择,渝棉1号,T586,T586,渝棉1号,群体大于1000,可靠性取决于标记与目标基因的连锁程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。,第四节 分子标记辅助选择（MAS）育种,一、分子标记辅助选择的遗传基础,1、前景选择,对目标基因的选择称为前景选择(foreground
18、selection),Hospital & Charcosset (1997)提出,供体,受体,RR Rr rr (1-r)2 2r(1-r) r2,MR,mr,MR,mr,目标基因与DNA标记间的遗传距离位p,亲本中DNA标记的带型,F1杂种中DNA标记的带型,在F2分离群体中分子标记类型即MM,Mm,mm,MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率,利用MAS的遗传基础（以RFLP为例）,M抗性标记 R抗性基因m感病标记 r感病基因,选择的正确率随重组率的增加而迅速下降。重组值越小，其错选率越低。,如果要求至少选到一株目标基因型的概率为P，则必须选择具有标记基因型MM的植株至少为： nl
19、og（1-P）/log（1-p） 式中p（1r）2,对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（background selections）。背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中，由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。,2、背景选择,二、分子标记辅助选择的优越性,1.克服性状表现型鉴定的困难2.允许早期选择3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用4.允许同时选择多个性状5.可进行性状非破坏性评价和选择6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率,三. 分子标记辅助选择应
20、具备的主要条件,A：与目标基因紧密连锁的分子标记,B: 简便快捷的标记检测方法,How to use a genetic marker for marker-assisted selection,Weaver Carrier Sire,+,W,W,+,+,+,M1,M2,M1,M2,M3,M3,W=Weaver +=Normal,目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备三个条件：,分子标记与目标基因紧密连锁标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。不同遗传背景选择有效。,作物MAS育种须具备的条件 分
21、子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PCR技术。筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。,四、MAS育种方法（一）回交育种（二）SLS-MAS（三）MAS聚合育种,受体亲本 供体亲本 (不含优质基因) (含优质基因),F1 受体亲本,BC1,目标基因定位,标记辅助选择,中选BC1 受体亲本 (含优质基因),BC2,BC3,标记辅助选择,标记辅助选择,中选BC3(含优质基因),新育成的优质品种(受体亲本遗传本背景
22、+优质基因),自交,目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合程序图,中选BC1 受体亲本 (含优质基因),受体亲本 供体亲本A(无优质基因) (含优质基因A),受体亲本 供体亲本B(无优质基因) (含优质基因B),F1(含优质基因A) F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本 供体亲本C(无优质基因) (含优质基因C),中选杂种个体 F1 (含优质基因A和B) (含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体 受体亲本(含优质基因A、B和C),新育成的优质品种 (受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标记辅助选择,自交,标记辅助选择,标记辅助选择,标记辅助基因聚合,
23、与品质改良相结合程序图,五、提高分子标记的筛选效率,（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子标记进行育种选择（三）克服连锁累赘（四）降低MAS育种的成本,MAS育种研究范围：1.分子标记与资源评价（度量遗传多样性）2.分子标记与亲本选配3.MAS增强作物抗病性（转移新的抗性基因，抗性基因的累加或聚合）4.MAS提高作物杂种产量,品质性状分子标记体系,HMWGS：2*、7、5、8、9、16、20硬度：Pina/Pinb淀粉：Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1多酚氧化酶：2个黄色素：1个,抗病分子标记体系,条锈：Yr5、Yr ZH84、Yr10、Yr24白粉：Pm12、Pm16、Pm31,HMW-G
24、S、LMW-GS的SDS-PAGE分析,-Gliadin,SDS-PAGE of 1BL/1RS translocation,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20,PCR marker development for By8,Dominant PCR marker system specific to glutenin By8,527bp,M,By18,By8,By18,By16,By16,By8,By9,By9,By15,By8,By8*,By20,By8*,By20,By-null,M 1 2 3 4 5 6 7,1. CS 2. X( N4AT4B) 3. X(N4AT4D) 4. Beihuomai 5. Kanto107 6. Lu935031 7. Gamenya,Molecular identification of Wx-B1 in Chinese wheat,PPO新标记品种检测,876 bp685 bp,硬度 27 65 27 76 24 60 19 21 26,Friabilin蛋白电泳图谱，箭头示硬度相关谱带,
