1、2018年7月3日星期二,1,外源基因在真核细胞中的表达,2018年7月3日星期二,2,第一节 概述,在进行人的特定基因表达时，真核细胞表达系统是首要的选择，尤其是对于功能性膜蛋白、需要翻译后修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复合体中的蛋白组分等，这些蛋白质往往只能在真核细胞表达系统中才能获得有活性的表达产物。其原因有：,2018年7月3日星期二,3,1、真核蛋白在原核宿主中不稳定2、表达出来的蛋白质不能有效、正确的折叠及二硫键配对错误3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸化和羧化等翻译后修饰以及对原核细胞有毒性。,2018年7月3日星期二,4,一、真核细胞表达宿主的种类及优势,不同表达系统蛋白质表达及翻
2、译后修饰情况的比较,大肠杆菌 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞,产率 060% 010% 030% 01%蛋白酶消化 / / 糖基化 分泌 / 折叠 / / 磷酸化 酰基化 酰胺化 ,2018年7月3日星期二,5,二、真核细胞表达外源基因的意义,研究基因表达产物的功能,生产有生物活性的蛋白质,1、将目的基因导入各种细胞中，观察表达产物对细胞活动的影响从而推论其功能特征,2、通过突变研究基因表达产物功能区及关键位点,3、制备过量表达产物用于结构分析,2018年7月3日星期二,6,外源基因导入真核细胞的基本方法,病毒感染,转染,化学法,物理法,DEAE葡聚糖法,磷酸钙共沉淀法,脂质体介导法,醋酸锂
3、法,电穿孔法,显微注射法,2018年7月3日星期二,7,三、外源基因在真核细胞中表达的主要方式,1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主染色体整合，不能随宿主基因组的复制而扩增，只能在细胞内维持23天,2、稳定表达：转染的DNA与宿主染色体整合，能随宿主基因组的复制转录和翻译，并被稳定遗传。,2018年7月3日星期二,8,五、外源基因在真核细胞中表达产物的鉴定和纯化,mRNA的鉴定,蛋白产物鉴定,mRNA的鉴定：印迹杂交或反转录PCR,蛋白产物鉴定：免疫印迹或电泳,提取方法有：沉淀法、电泳法、层析法等,2018年7月3日星期二,9,哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系
4、统，是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。,2018年7月3日星期二,10,但该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞表达系统通常用来生产用常规方法无法获得的真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，基因工程单抗等。 CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋白生产的首选体系。,2018年7月3日星期二,11,哺乳动物细胞表达体系的优点,哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系
5、不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。,2018年7月3日星期二,12,实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。,2018年7月3日星期二,13,分泌型哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中
6、被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。,2018年7月3日星期二,14,第二节外源基因在哺乳动物细胞中表达,一、哺乳动物细胞表达载体,（一）质粒型载体：通过对细菌质粒改造获得。一般为在原质粒的基础上，插入了一些病毒或其它一些物种及人的基因表达调控序列。,1、哺乳动物细胞质粒表达载体的结构典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件：,2018年7月3日星期二,15,（1）启动子,常用的启动子种类及其各自的强度,启动子 来 源 强 度,EF 1 人延长因子1基因 401
7、60,CMV 人巨细胞病毒立早基因 4,RSV 劳斯肉瘤病毒LTR 2,SV40 later 猿猴病毒40晚期基因 1.1,SV40 early 猿猴病毒40早期基因 1,Adeno major late 腺病毒主要晚期启动子 0.4,globin 小鼠珠蛋白基因 0.2,2018年7月3日星期二,16,（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所有真核细胞mRNA3末端都具有Poly(A)结构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化位点上游1130核苷酸的保守序列AAUAAA和一个下游的GU或U富含区组成，,2018年7月3日星期二,17,哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区,Poly A区 来
8、源 效 率,BGH 牛生长激素 3 SV40 late 猿猴病毒40晚期基因 2 TK 单纯疱疹病毒腺激酶 1.5 SV40 early 猿猴病毒40早期基因 1 Hep B 乙肝表面抗原 1,2018年7月3日星期二,18,（3）选择标记,1)药物选择标记基因,a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G-418可以干扰真核细胞核糖体的功能而阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶，因此可以在含G-418的培养基中生长。,2018年7月3日星期二,19,b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸
9、脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为Xyl-ATP并结合到核酸分子中而导致细胞死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生物而解毒。,c、博来霉素抗性基因：,d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷酸转移酶,2018年7月3日星期二,20,2）报告基因：,3）表位标签,氯霉素乙酰转移酶(CAT),常用的表位标签有GST(谷胱甘肽转移酶)、人IgG1的Fc区、FLAG等,2018年7月3日星期二,21,(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞内进行自主复制。不同的病毒复制子的工作效率不同，常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头
10、瘤病毒等的复制子。,2018年7月3日星期二,22,常用的哺乳动物表达质粒载体,1、pcDNA3.1：由Invitrogen公司提供的目前应用最多的真核质粒表达载体之一。其主要特征包括：,1)有高效表达的CMV启动子,2)有多克隆位点,3)有牛生长激素多腺苷酸化信号,2018年7月3日星期二,23,2018年7月3日星期二,24,pSI：该质粒出自Promega公司，含SV40增强子区，在其下游还有珠蛋白/IgG嵌合内含子，可进一步增强表达。多腺苷酸化信号为晚期SV40多腺苷酸化信号。可用于瞬时转染和稳定转染。该载体本身不含选择标记，若用于稳定转染，必须与含选择标记基因的表达载体一起进行共转染
11、。,2018年7月3日星期二,25,2018年7月3日星期二,26,pCMV-HA：为Clontech公司产品，该质粒载体含CMV启动子，在CMV下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内含子，在N端有血凝素(HA)表位标签和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。,2018年7月3日星期二,27,2018年7月3日星期二,28,pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一个双启动子（CMV和EF-1）质粒载体，在每个启动子下游都有多克隆位点，用此质粒可同时实现两个基因的独立表达。若用来制备稳定表达的细胞株，该载体可以确保相同拷贝数的基因被同时表达。,2018
12、年7月3日星期二,29,2018年7月3日星期二,30,pTRE：与pTet-Off(或pTet-On)质粒一起构成四环素或强力霉素诱导表达载体系统多用于建立细胞毒性基因稳定转染的细胞系，并研究该基因诱导表达对细胞的影响,2018年7月3日星期二,31,2018年7月3日星期二,32,2018年7月3日星期二,33,二、病毒型载体,1、逆转录病毒载体：为RNA病毒，进入处于增殖状态的细胞后，在细胞分裂过程中反转录成DNA并整合入宿主基因组而进行稳定表达。整合位点随机，在基因组内的整合可能破坏一些重要的基因位点,2018年7月3日星期二,34,逆转录病毒是RNA病毒，RNA基因组转变成DNA，能
13、有效地整合到宿主基因组中，长久地在宿主基因组中寄宿，并在每次细胞分裂时，随宿主DNA一起复制。整合的原病毒依靠基因组末端的强启动子(长末端重复LTR序列）稳定地产生病毒RNA。此病毒RNA既产生病毒蛋白质的mRNA，又产生新病毒的基因组RNA。,二、病毒型载体,2018年7月3日星期二,35,(1)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)，在病毒颗粒内含有四条RNA分子，较大的两条为反转录病毒基因组，它编码病毒的全部遗传信息，另外两条小的RNA分子为寄主细胞的tRNATrp。,2018年7月3日星期二,36,(2)、pLNCX：由Clontech公司构建的，含有Molon
14、ey小鼠白血病病毒和Moloney小鼠肉瘤病毒的一些元件及来自pBR322的一些元件组成。,2018年7月3日星期二,37,2018年7月3日星期二,38,逆病毒的结构和载体结构,2018年7月3日星期二,39,逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因,原病毒DNA转染进包装细胞中，包装原病毒产生将病毒RNA包装成感染性病毒粒子的所有蛋白质，但却不能包装自身的RNA,2018年7月3日星期二,40,2、腺病毒载体：人腺病毒包括六个亚属，目前用来构建基因表达载体的腺病毒主要是C亚属的2型病毒和5型病毒。为双链线性DNA，在双链DNA的两端各有一个反向重复序列LTR，,2018年7月3日星期二,41,
15、2018年7月3日星期二,42,3、牛乳头瘤病毒(BPV)病毒基因组为双链DNA，全长7095kb。能在体外转化啮齿动物细胞，转化受体细胞后以染色体外DNA的形式存在，细胞中病毒DNA的拷贝数一般可达到20100。以BPVDNA构建的表达载体可以在多种哺乳动物细胞中低水平或中等水平表达。,2018年7月3日星期二,43,4、人疱疹病毒(EBV)衍生载体：EB病毒可以将休止状态的人B淋巴细胞转化为能在培养基条件下无限增殖的分裂母细胞。以EB病毒DNA为基础构建的表达载体可在范围广泛的哺乳动物细胞中低水平或中等水平表达外源基因，对允许插入的外源基因片段的大小没有严格的限制。,2018年7月3日星期
16、二,44,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40的基因组DNA,t / T基因编码病毒的小抗原和大抗原与病毒的致癌作用密切相关,SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白,2018年7月3日星期二,45,2018年7月3日星期二,46,重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。,SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建,2018年7月3日星期
17、二,47,pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷丙转氨酶基因，用于筛选重组子。,2018年7月3日星期二,48,猴多瘤病毒DNA（SV40）,利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序,SV40 载体,病毒晚期基因启动子,筛选标记,ori,缺陷的SV40 辅助病毒,去除细菌序列,插入外源基因,重组分子,分离病毒DNA,转化,筛选,增殖,感染,2018年7月3日星期二,49,猴多瘤病毒DNA（SV40）,基因表达好 外源基因能高效表达,SV40 DNA载体的特点,基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象,宿主范围窄 只能转染猴细胞
18、,装载量较小,2018年7月3日星期二,50,人牛痘病毒DNA,人牛痘病毒的生物学特性,人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。,2018年7月3日星期二,51,目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表
19、达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。 人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。,2018年7月3日星期二,52,人牛痘病毒DNA,利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序,牛痘病毒启动子,T7 RNA聚合酶基因,T7启动子,外源基因,细菌重组质粒,感染,转化,培养,收集,2018年7月3日星期二,53,杆状病毒DNA,杆状病毒能够感染昆虫细胞的DNA病毒，将外源基因克隆在携带一部分病毒基因组、且位于病毒外壳蛋白基因位置的质粒上。用重组质粒与野生型杆状病毒D
20、NA一起共转染昆虫细胞，质粒和病毒DNA通过同源重组，将外源基因插入到病毒基因组中。,2018年7月3日星期二,54,用杆状病毒进行蛋白质的高效表达,2018年7月3日星期二,55,常用的哺乳动物细胞的表达系统,选择原则1、细胞来源丰富2、重组子转化率高3、表达效果好4、易于培养,2018年7月3日星期二,56,由于大多数动物组织细胞具有表面接触抑制作用，只有肿瘤组织永生细胞系才能表现为无限生长，而且生长速度快，但肿瘤细胞的生理特性与正常细胞存在较大的差异。因此，在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特征尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞，目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞
21、有：,2018年7月3日星期二,57,用于稳定表达的细胞：小鼠的L-细胞、Lik细胞和NIH 3T3细胞等。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0和NSO等以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等,常用的人细胞株包括HEK293、HeLa、HL-60等细胞。,2018年7月3日星期二,58,用于瞬间表达的细胞,COS细胞源于非洲绿猴肾细胞系(CV-1)，CV-1细胞经复制起始区缺陷的SV40病毒基因组转化后，产生能组成性表达SV40的大T抗原的COS细胞株。COS的特点为：,1、细胞来源丰富,2、细胞易于培养和转染,3、能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的质粒载体快速复制。,2018年7月3日星期二,59,H
22、EK 239是一种来自于有5型人类腺病毒DNA的人胚胎肾脏细胞的细胞株。含有腺病毒A1A基因，可激活带CMV启动子的质粒，导致目的基因的高水平表达。,鼠骨髓瘤细胞包括（Sp2/0、NS0和J5581等）特点：细胞易于培养和转染；可以在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，能进行糖基化修饰。,2018年7月3日星期二,60,哺乳动物细胞的基因导入方法,磷酸钙或DEAE-葡萄糖介导的转染法原理：哺乳动物细胞能够捕获黏附在其表面的DNA-磷酸钙沉淀物，并能将DNA转入细胞中，从而实现外源基因的导入。DEAE（二乙胺乙基葡聚糖）与DNA结合后抑制了核酸酶的活性，或DEAE与细胞结合后促进了
23、DNA的内吞作用。适用：哺乳动物细胞,2018年7月3日星期二,61,磷酸钙共沉淀法,将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；,将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37保温4-16小时此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；,弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。,哺乳动物细胞的物理转化法,2018年7月3日星期二,62,利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染,2018年7月3日星期二,63,哺乳动物细胞的物理转化法,电穿孔转化法,将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的
24、样品槽内，受到短暂电脉冲的作用使细胞膜能产生瞬时穿孔，DNA通过孔直接进入细胞质。,电穿孔转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。,2018年7月3日星期二,64,高压电穿孔法原理：在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜由于电位差太大而产生空隙，从而高分子和低分子物质得以进入细胞质内，但不会伤害到细胞。切断电场后，被击穿的膜孔可自行复原过程：把宿主细胞置于外加电场中，通过电场脉冲在细胞膜上打孔，DNA分子进入细胞。条件：电压：300600V 维持时间：20100ms 温度：0主要用于真核生物，如酵母菌和霉菌等,2018年7月3日星期二,65,利用电穿孔进行基因转移
25、,2018年7月3日星期二,66,脂质体介导法,将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。,将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。,利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa细胞。,哺乳动物细胞的物理转化法,2018年7月3日星期二,67,脂质体介导的基因转移,2018年7月3日星期二,68,(1)通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；,(2)借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄性原核内。,(3)上述
26、程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操作，所以不太适用于基因的克隆和表达。,显微注射法,哺乳动物细胞的物理转化法,2018年7月3日星期二,69,2018年7月3日星期二,70,2018年7月3日星期二,71,基因枪介导的DNA转移,基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。,2018年7月3日星期二,72,基因枪转化的原理,2018年7月3日星期二,73,多聚物介导法原理：聚乙二醇（PEG）和多聚赖氨酸与二价阳离子（Mg2+
27、、 Ca2+、 Mn2+)及DNA混合后，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，从而使DNA进入。适用：酵母菌等真菌细胞，也适合动物细胞,2018年7月3日星期二,74,3-6 磷酸钙或DEAE-葡萄糖介导的转染法原理：哺乳动物细胞能够捕获黏附在其表面的DNA-磷酸钙沉淀物，并能将DNA转入细胞中，从而实现外源基因的导入。DEAE（二乙胺乙基葡聚糖）与DNA结合后抑制了核酸酶的活性，或DEAE与细胞结合后促进了DNA的内吞作用。适用：哺乳动物细胞,2018年7月3日星期二,75,脂质体介导法脂质体：人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状结构。原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体颗粒带正电荷，利用引力
28、作用，把DNA、mRNA及单链RNA等导入细胞内过程：在形成脂体时，把用来转染的目的DNA分子包在其中将该种脂质体与细胞接触外源DNA分子导入受体细胞主要适用于真核细胞,2018年7月3日星期二,76,提高哺乳动物基因表达系统表达效率的因素,外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达与表达载体的性质密切相关，因此，改进表达载体是提高外源基因表达水平和产量的重要环节。,1、启动子：表达载体启动子强度和宿主范围是外源基因高效表达的关键因素。一般来说，选择哺乳动物细胞内源性强启动子可获得高表达。,2018年7月3日星期二,77,2、外源目的基因的表达水平与细胞中基因的拷贝数相关，尤其对于瞬时表达系统，在构建
29、载体时可考虑将载体构建为一种自我复制型载体，使载体以附加的形式在宿主细胞内自主复制或将外源基因与选择标记基因的表达结合在一起，当细胞在选择压力下培养时，两种基因产物才能获得高表达。,2018年7月3日星期二,78,3、根据表达载体和外源蛋白的特性对宿主细胞进行改造或采用新的宿主细胞系统可提高外源基因的表达水平。不能用同一细胞株和载体表达所有的外源蛋白。,4、哺乳动物细胞存在程序性细胞死亡基因，但在生物反应器中这种细胞死亡还受细胞培养条件的影响。通过改变各种因素可以达到抑制细胞凋亡、延长细胞周期，提高外源基因表达效果。,2018年7月3日星期二,79,5、哺乳动物蛋白的重要特点是糖基化，提高表达
30、蛋白糖基化水平可以改善哺乳动物蛋白的特性。提高表达蛋白糖基化的方式有1)寻找不同类型的哺乳动物宿主细胞，包括人类细胞，使其尽可能与人类天然蛋白质的糖基化相同或相似；2)通过基因工程方法将某些糖基化本科引入宿主细胞中，使表达蛋白有交糖基化。,2018年7月3日星期二,80,植物细胞基因表达系统,植物细胞基因表达系统一般用于转基因生物，当一个转基因体细胞经过诱导和分化后可发育成为一棵转基因植株，每棵转基因植株就成为一个具有能适应环境变化并进行自我调节的生命系统。转基因植物能进行光合作用，增选条件非常简单，生产成本低廉。因此，转基因植物技术在未来的农业和医药领域有非常广阔的前景。,2018年7月3日
31、星期二,81,2018年7月3日星期二,82,植物细胞基因表达与调控的特点,高等植物基因结构与动物基因结构相似，表达调控包括：转录前调控、转录水平调控、转录后加工调控、转动调控和翻译水平调控。其中转录水平的调控是主要环节。主要的顺式作用元件有：启动子、子和抑制子等。,2018年7月3日星期二,83,启动子：通常由TATA盒、上游的CAT盒及GC盒组成，富含GC碱基，此类启动子调控的基因一般具有较高的转录活性。另一类启动子不含TATA盒及GC盒，而由一个或多个紧密相连的转录起始位点组成。一般活性很低或无活性，在个体发育或组织分化中接受特异的调节信号而启动转录。,2018年7月3日星期二,84,增
32、强子：植物基因的增强子类似于启动子，由若干个单元组成，其功能是通过结合特定的转录因子而影响DNA的构象，进而启动基因的转录。,抑制子：与增强子的作用相反的顺式作用元件，通过阻断增强子顺式作用元件的活性而实现转录调节活性。,2018年7月3日星期二,85,植物基因表达载体的组成特性,大多数植物基因表达载体是以Ti质粒为基础而成，其组成包括启动子、T-DNA、终止子和报告基因等,2018年7月3日星期二,86,Ti 质粒的结构 i. 环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱
33、分解,2018年7月3日星期二,87,iv) Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制,2018年7月3日星期二,88,2018年7月3日星期二,89,农杆菌共培养侵染,诱导愈伤组织,分化生芽,生根,叶盘转化法,(1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。,2018年7月3日星期二,90,Ti质粒的结构,2018年7月3日星期二,91,根据功能将Ti质粒启动子分为：,组成型启动子：外源基因在不同组织中按一定水平表达。,诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号的刺激下改变转
34、录水平。,组织特异性启动子：,2018年7月3日星期二,92,组成型启动子主要有烟草花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子和章鱼碱合成酶基因启动子等诱导型启动子有：光诱导启动子、热诱导启动子、创伤诱导启动子等,2018年7月3日星期二,93,T-DNA序列：是构建植物基因表达载体的重要元件。外源基因重组子在植物细胞中有两种存在方式：,1、以整合形式进行稳定表达；,2、以质粒形式进行瞬间表达：质粒独立于染色体DNA进行复制，但不稳定，携带外源DNA的质粒最终会消失。,2018年7月3日星期二,94,Ti质粒的结构,2018年7月3日星期二,95,T-DNA的5端和3端有真核生物基
35、因表达信号，如：TATA盒、AATAA盒和加尾信号及与外源基因整合相关的边界序列（25bp正向重复序列）,内含子序列：真核基因常被一个或数个内含子所分隔，转录后的前体mRNA经剪切后变为成熟的mRNA。研究表明，内含子与基因表达水平有很大关系。,2018年7月3日星期二,96,例如：将蓖麻基因的内含子插入Gus基因后可使Gus表达活性在水稻细胞中提高90倍。,一般认为，加入内含子可使能有效提高细胞中成熟mRNA的含量，从而有利于基因的表达。所以，在构建植物基因表达载体时，可根据不同基因的类型，有选择性地插入内含子。,2018年7月3日星期二,97,选择标记基因与报告基因,选择标记基因：是植物基
36、因表达载体的重要组成元件，编码一种正常植物细胞中不存在的酶，且基因小并可与外源基因构成嵌合基因，能在转化体中有效表达并易于检测或定量分析。其功能是在选择压力下将转化体筛选出来，其实质是野生植物细胞生长的抑制剂，但对转化细胞的生长和分化不发生影响。,2018年7月3日星期二,98,常用的选择标记基因有：,报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因。常用的报告基因NPT-II 新霉素磷酸转移酶基因 抗氨基环醇类抗生素CAT 氯霉素乙酰转移酶基因 抗氯霉素HPT 潮霉素磷酸转移酶基因 抗潮霉素GUS -葡萄糖苷酸酶基因 产生蓝色物质GFP 绿色荧光蛋白基因 产生绿色荧光LUC
37、荧光酶素基因 发射光子DHFR 二氢叶酸还原酶Gent 庆大霉素抗性基因,2018年7月3日星期二,99,gfp基因的检测,绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。,2018年7月3日星期二,100,GFP（绿色荧光蛋白基因）;LUC (萤火虫荧光素酶基因);,报告基因:,2018年7月3日星期二,101
38、,2018年7月3日星期二,102,2018年7月3日星期二,103,2018年7月3日星期二,104,植物基因表达的受体系统,植物细胞基因表达受体是指用于转化的植物细胞，它应该具有：,1、高效稳定的再生能力：植物细胞具有全能性，但对于不同细胞部位的细胞来说，其全能性存在明显的差异，与细胞的分化程度和生理状态有关，用于植物基因表达受体细胞的再生率一般要高于80。,2018年7月3日星期二,105,2、较高的遗传稳定性：受体细胞接受外源基因后应不影响其分裂和分化，并能保持遗传的稳定性。,3、具有稳定的外植体来源。,4、对选择性抗生素敏感，便于转化株的筛选。,5、对农杆菌侵染敏感，能有效接受外源基
39、因。,2018年7月3日星期二,106,主要的植物细胞基因表达受体系统,愈伤组织再生系统：由外植体经脱分化培养、诱导愈伤组织并通过分化培养获得再生植株的受体系统。特点：易于接受外源基因、转化效率高；扩繁量大，可获得大量的转化植株；但获得的再生植株无性系变异较大、外源基因的稳定性较差。,2018年7月3日星期二,107,主要的植物细胞基因表达受体系统,直接分化再生系统：是外植体细胞不经过脱分化阶段而直接分化出不定芽而获得的再生株。特点：获得再生植株的周期短，细胞无性系变异小能较好地保持受体细胞的遗传稳定性；转化频率相对较低，存在较多的嵌合株。,2018年7月3日星期二,108,主要的植物细胞基因
40、表达受体系统,原生质体再生系统。特点：能高效地转化外源基因，可形成基因型一致的细胞克隆培养周期较长、难度大；再生频率较低；在原生质体的培养过程中易造成变异。,2018年7月3日星期二,109,主要的植物细胞基因表达受体系统,胚状体再生系统：是指体细胞或单倍体细胞在组织培养条件下诱导成为形态和功能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。特点：具有很强接受外源DNA能力、转化效率高；获得的嵌合体少；胚状体具有两极性，在发育过程中可同时分化出芽和根、形成完整的植株；利用胚状体可生产人工种子。,2018年7月3日星期二,110,主要的植物细胞基因表达受体系统,生殖细胞受体系统：是以生殖细胞
41、如花粉、卵细胞等作为基因转化的受体细胞，通过组织培养技术将生殖细胞诱导成为胚性细胞或愈伤组织，或直接利用花粉和受精卵受精过程进行基因转化。特点：转化效率高，易于获得稳定的遗传；通过加倍后成为纯合的二倍体。,2018年7月3日星期二,111,提高外源基因在植物细胞中表达效率的策略,1、构建高效表达的转化载体是提高外源基因在植物细胞中表达的有力措施。包括：,1)选择合适的启动子类型；2)组入完整的基因表达调控序列，如5端调控序列和3端调控序列；3)合理插入内含子提高外源基因表达水平；4)合理使用转译过程中的调控序列，有利于转译和转译后的调控。,2018年7月3日星期二,112,提高外源基因在植物细
42、胞中表达效率的策略,2、正确利用增强子：大多数植物基因的增强子具有组织特异性，对于不同的植物受体系统使用相同来源的增强子可保证增强子对基因转录的有效调控，从而提高表达效率。,2018年7月3日星期二,113,3、防止外源基因的失活：在某些情况下外源基因的重复拷贝、DNA的甲基化、染色质结构重排和转录后产物的不稳定等导致基因沉默。实际工作中可通过分离单拷贝转基因个体或改变转化方法获得较多 的转基因株系。此外还可以通过构建含有核基质支架附着区的转化载体，改进外源基因在细胞中的稳定性，从而提高基因表达效率。,2018年7月3日星期二,114,4、优化先导序列，提高翻译效率5、优化先导序列及mRNA上
43、与核糖体结合的序列对起始翻译起重要作用，从而可大大提高起始翻译的效率。,2018年7月3日星期二,115,原生质体介导法,概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或 物理手段将外源直接导入植物细胞 的方法。 主要方法: 1) PEG介导的基因转化 2) 脂质体（liposome)介导的基因 转化 3) 电激法 4) 激光导入法 5) 显微注射法,2018年7月3日星期二,116,PEG介导的基因转化,原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚 烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子， 进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。 案例：转基因烟草,2018年7月3日星期二,117,世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。,2018年7月3日星期二,
