1、项目五 污染物的生物降解和转化,【项目简介】,目前已知的环境污染物质达数十万种，其中大多为有机物。有机物在环境中可经历光解、化学分解与生物分解等分解途径。其中以生物分解作用最大。 微生物的活动对重金属汞、砷和硒的甲基化有重要作用。微生物细胞依靠通用机制和专性机制抵抗重金属的毒性。 生物修复是近十多年来蓬勃发展的一项治理环境污染的技术，它们与生物处理有着许多共性并有很多相同。,【项目简介】,知识目标：1.了解有机污染物农药、洗涤剂、炸药、塑料的生物降解和代谢方式。2.正确理解细菌和真菌使金属甲基化过程，了解微生物金属转化作用污染控制中的利用。3.掌握污染环境微生物修复原理和生物修复技术应具备的条
2、件。,技能目标：1.能驯化有机氯农药降解菌2.会分离与筛选有机氯农药降解菌【项目实施方案】详见教学文本P3435【相关知识点】,有机物的生物降解,一、农药的生物降解 （一）农药概述从上世纪40年代开始，合成农药崭露头角，相继出现了六六六(BHC)、滴滴涕(DDT)、艾氏剂、硫丹有机氯杀虫剂以及三氯杀螨砜、三氯杀螨醇等有机氯杀螨剂等。随后出现了有机磷农药，如对硫磷、内吸磷、马拉硫磷、敌百虫、二嗪磷、乐果、甲拌磷等。,1956年又出现了第三大类合成杀虫剂氨基甲酸酯类，如速灭威、仲丁威、涕灭威，其中涕灭威内吸性能极好，但毒性极大，只能作拌种用。在合成杀虫剂的启示下，各类合成的杀菌剂相继问世。有含三氯
3、甲硫基的克菌丹、敌菌丹，属于氨基甲酸酯类的代森类、福美类，属于有机磷的克瘟散、稻瘟净、乙磷铝，属于苯并咪唑类的多菌灵及三唑类的粉锈宁。,农业上和卫生上大量地使用农药，出现了不少环境和生态问题，人们注重开发高效低毒低残留新农药，如研制“仿生”农药，如除虫菊酯类农药、沙蚕毒素农药和印楝素农药，利用昆虫的内激素(保幼激素)和外激素(性激素)。但是还不得不使用合成农药，这些物质有的能迅速降解，有的则在环境中长期存留。,各种化学农药共同的危害特性：有毒性，对侵染农作物的病、虫、菌、草有杀灭或抑制作用；多数在自然界中比较稳定，不易分解，如有机氯农药，具有足够长的有效期；具有脂溶性，易于被病、虫、菌、草吸收
4、并在体内累积，沿食物链传递到人和其他生物体内，在脂肪、肝、肾等部位沉积。 因此，研究合成农药的降解性成为环境微生物学研究的重要内容。,（二）有机氯农药六六六，化学名称1,2,3,4,5,6-六氯环己烷，曾是主要的有机氯杀虫剂。工业产品是多种异构体的混合物，但只有丙体六六六(-BHC，林丹)才有杀虫活性。BHC稳定持留期长，微生物在厌氧条件下分解较快: 例如在高温渍水条件下-BHC在一个月内母体完全消失，但在干旱土壤中可持留311年之久。,据报道，白腐菌黄孢原毛平革菌可以使林丹矿化。厌氧代谢林丹的有梭菌、恶臭假单胞菌、大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸杆菌等。林丹在厌氧条件下还原脱氯化氢(图6.1-1)，
5、降解产生-四氯环己烷和氯苯。,和-BHC异构体的降解比BHC的降解缓慢。虽然好氧菌或兼性菌在厌氧条件下也可以脱氯，但是以专性严格厌氧条件下最好。,图6.1-1林丹的厌氧降解,滴滴涕，化学名称为二氯二苯基三氯乙烷，也曾经是广泛使用的有机氯杀虫剂，它对人、畜急性毒性不大，但由于性质稳定，不易分解，通过食物链容易积累于鱼、动物组织以及积蓄于人体中产生危害，故现在停止使用。DDT以在厌氧条件下分解为快。大约有300个菌株的微生物可以使DDT转化为DDD1，1二氯2,2双(对氯苯基)乙烷。其中包括假单胞菌、梭菌、拟杆菌、肠杆菌和变形菌等，还有一些放线菌和霉菌。,在厌氧和好氧结合的条件下，DDT可能完全矿
6、化。DDT在厌氧条件下代谢产生对二氯二苯基甲烷(图6.1-2；然后，氯原子在经过一系列的还原性脱氯；再经其它微生物作用，如假单胞菌和脱卤真菌，使苯环裂解。,图6.1-2DDT的好氧和厌氧代谢方式,（三）有机磷农药 有机磷农药急性毒性很高，但是可以迅速代谢，很多细菌可以降解它们，最常见反应机制是脂酶水解过程。例如对硫磷的主要降解途径如图6.1-3。对硫磷转化为4硝基酚和二乙基硫代磷酸酯，或先转化为对氧磷或氨基对硫磷再进一步降解。,（四）氨基甲酸酯类农药 涕灭威可用于农作物的杀虫剂和杀线虫剂。涕灭威(硫醚)的好氧生物降解的第一步是氧化为涕灭威硫氧化物，然后氧化为涕灭威砜。厌氧条件下涕灭威的降解明显
7、高于好氧条件。 呋喃丹在农业上广泛使用，它在碱性条件下化学水解，在42 h内可被无色杆菌-水解，添加葡萄糖作为碳源，呋喃丹为唯一氮源。其最初的水解是在氨基甲酸酯键上。含有混合培养物的土壤能够使水解的呋喃丹矿化，在厌氧条件下没有明显的降解。,图6.1-3对硫磷的水解,（五）合成除虫菊酯类农药 合成菊酯类农药由于其对哺乳动物的低毒性正在取代其它杀虫剂。据报道菊酯类农药在好氧和厌氧条件下均可降解。氯菊酯的好氧降解过程见图6.1-4。行转化的微生物有荧光假单胞菌-、产碱菌-和蜡样芽孢杆菌。,图6.1-4氯菊酯的好氧降解,（六）氯代苯氧羧酸类农药 这类除草剂有2,4-D、2,4,5-T和2甲4氯等。2,
8、4-D是最早开发的苯氧羧酸类除草剂，杀草活性高，选择性强。2,4,5-T效果更佳，但是由于合成过程中有二恶英产生，有高度致畸作用，已被很多国家禁用。 大多数苯氧羧酸类可为微生物降解。微生物转化的主要方式有苯环羟化、长链脂肪酸的-氧化以及苯环或醚键的裂解。,许多好氧微生物均可以降解2,4-D。其中一种好氧生物降解2,4-D的途径见图6.1-5。 几乎所有的氯代苯氧羧酸类除草剂均可以在厌氧条件下还原性脱卤。在厌氧微生物的作用下，2,4-D和2,4,5-T脱氯原子和醚键裂解产生氯酚(图6.1-6)。,图6.1-5 2,4-D的好氧降解,图6.1-6 2,4-D和2,4,5-T的厌氧脱卤,（七） 多氯
9、联苯的微生物降解 多氯联苯(PCBs)是人工合成的有机氯化物，作为稳定剂，用途很广(润滑油、绝缘油、增塑剂、热载体、油漆、油墨等都含有)。PCBs有毒，对皮肤、肝脏、神经、骨骼等都有不良影响，且是一种致癌因子。 1968年日本的“米糠油事件”即是由于食用了PCBs污染的米糠油而引起的。PCBs化学性质极其稳定，在环境中很难分解，由于它是脂溶性的，很容易在脂肪中大量累积。,现已发现厌氧细菌可以进行好氧条件下不能进行的特殊脱毒反应，而且厌氧微生物降解方法已经被发展用于混合培养体系中去除有毒有机物。通过共代谢作用、降解性质粒以及微生物之间的互生关系等途径，也可使多氯联苯降解、转化。,二、炸药的生物降
10、解TNT(2,4,5-三硝基甲苯)和RDX(黑索金，环三亚甲基三硝基)是主要的常规炸药品种。这些炸药对许多生物体有毒性和致癌性，与TNT接触可以引起各类血细胞减少症、肝损伤和贫血症。世界各国都有RDX职业中毒的报导，主要引起中枢神经系统中毒。,有多种微生物可以降解TNT。包括细菌、酵母、霉菌和白腐菌。在厌氧和微好氧条件下，TNT的硝基被逐个还原为氨基，但以后的还原作用越来越缓慢和不完全(图6.1-7)。,图6.1-7TNT的还原性转化,在环境中，TNT中的NO2基团还原为羟胺，彼此结合形成二聚物，如2,2,6,6-四硝基-4,4-氧化偶氮甲苯、4,4,6,6-四硝基-2,2-氧化偶氮甲苯和2,
11、4,6,6-四硝基-2,4-氧化偶氮甲苯。因此，TNT降解只是表面上的修饰，苯环并没有分解，它们具有毒性和致癌性。白腐菌黄孢原毛平革菌可以氧化TNT和RDX，白腐菌的氧化还可以消除其它微生物产生的氧化偶氮代谢物。,（三）塑料和增塑剂的生物降解作为塑料和纤维使用的合成聚合物绝大多数是完全抗生物降解的，无论是利用好氧微生物和厌氧微生物都不能降解它们，细菌和真菌既不能利用它们作为碳源和能源，也不能进行共代谢。但是也有很少合成聚合物是可以生物降解的。 这类商业上重要的化学品有聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚酯型聚氨基甲酸酯、某些聚己内酯、聚酯和聚乳酸乙醇酸共聚物等。,邻苯二甲酸酯类，是一类普遍使用
12、的化学工业品，它主要作为聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯生产中的改性添加剂，用于增大产品的可塑性和提高产品的强度。 邻苯二甲酸酯也可用作农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂和去泡剂的生产原料。所以邻苯二甲酸酯类化合物已成为一种全球性的重要环境污染物。 生物降解是邻苯二甲酸酯类有机污染物分解的重要途径。,邻苯二甲酸酯的生物降解（如图6.1-8），首先在微生物酯酶的作用下，水解形成邻苯二甲酸单酯，再生成邻苯二甲酸和相应的醇。在好氧条件下，邻苯二甲酸在加氧酶作用下生成3,4-二羟基邻苯二甲酸或4,5-二羟基邻苯二甲酸后，形成原儿茶酸等双酚化合物，芳香环开裂形成相应的有机酸，进而转化成丙酮酸、琥
13、珀酸、延胡索酸等进入三羧酸循环，最终转化为CO2和H2O。,（四）、合成洗涤剂的微生物降解,合成洗涤剂的基本成分是人工合成的表面活性剂。合成洗涤剂使用后大部分以乳化胶体状废水排入自然界。根据表面活性剂在水中的电离性状，可分为阴离子型、阳离子型、非离子型和两性电解质四大类，以阴离子型洗涤剂的应用最为普遍，其中又以软型直链烷基苯磺酸盐(LAS)的使用最为广泛。,洗涤剂污染的废水会存在大量不易消失的泡沫，废水一般偏碱性。洗涤剂在水中的分解速度，主要取决于微生物的作用条件和洗涤剂中表面活性剂的化学结构。阴性表面活性剂中，高级脂肪链最易被微生物分解。其途径是，最初高级脂肪链经微生物作用形成高级醇类，然后
14、进一步氧化为羧酸，再在微生物的作用下分解为CO2和H2O。整个过程在有氧的条件下进行。,现已分离到能以表面活性剂为惟一碳源和能源的微生物，主要是假单胞菌属、邻单胞菌属的革兰阴性杆菌、黄单胞菌属的革兰阴性杆菌、产碱杆菌、微球菌、诺卡菌等，固氮菌属除拜氏固氮菌外，其他都是表面活性剂的积极分解者。在含洗涤剂的污水中培养固氮菌是很有意义的，因为它们固定了大气中的氮，水中含有机氮化物，就可促进其他微生物生长，从而提高洗涤剂的降解速率。微生物对洗涤剂的降解能力还依赖于共代谢途径和降解性质粒的存在。,二、重金属的生物转化,被污染的土壤和水体的有毒元素主要来自工业废水，废渣和垃圾。冶炼和采矿工业是向环境中释放
15、有毒元素的主要污染源。对人、畜毒害最大的污染元素有汞，镉，铅三种金属和砷，硒两种非金属，具中等毒性的有铬，镍，钼、锌等金属元素。污染的重要特征是能转化成各种不同形态，并通过分散和富集作用而迁移。,我国环保总局等部委(1998年)列出铍、铬、铜、锌、镉、锑、汞、铊、铅、镍、钡、砷、硒、碲等十四种元素为危险废物。从污染程度和毒性看主要污染物是汞、镉、铅、砷、铬等，涉及微生物转化的主要污染物有汞、砷、硒等。,（一）重金属及其毒性重金属进入机体后，不易排泄逐渐富积，可以导致机体中毒，主要有：慢性中毒，如汞污染引起的水俣病、镉污染引起的骨痛病等；致癌作用，如铬酸盐烟雾引起肺癌，使用高砷水引起皮肤癌、肺癌
16、和肝癌；致畸作用，如汞和铅可引起胎儿先天畸形；变态反应，如铬可引起眼结膜炎、支气管哮喘和接触性皮炎；,(二)甲基化作用最常甲基化的元素依次是汞、砷、硒和锡，其后是碲、铅和镉。不少细菌和真菌可使金属甲基化。细菌大多数是好氧菌，少部分是厌氧菌。微生物对于甲基化有选择性，杂色曲霉和灰绿曲霉甲基化砷，但是不能甲基化硒和碲，而产黄青霉、特异青霉和黑曲霉甲基化砷、硒和碲。,金属的甲基化作用有生物和非生物作用。生物作用过程比较复杂，有3种化合物与重金属生物甲基化有关：甲基钴胺素、N5-甲基四氢叶酸(N-CH3，THF)和S-腺苷甲硫氨酸。它们单独或联合作用于不同的金属，例如甲基钴胺素与Hg甲基化有关，S-腺
17、苷甲硫氨酸与As甲基化有关。甲基钴胺素是维生素B12的衍生物，其中的甲基来源于甲基供体，如N5-甲基四氢叶酸。钴胺素(辅酶)+N5-CH3THF甲基钴胺素,甲基钴胺素作为甲基供体提供不同类型的甲基，有负碳离子(CH3-)、自由基(CH3-)和正碳离子(CH3+)等几种形式。不同形式的甲基参与不同金属的甲基化，例如CH3-与高汞离子(Hg2+)甲基化有关，CH3+与二价硒(Se2+)的甲基化有关。,1. 汞的污染和微生物转化 在土壤和水体等自然环境中，汞的浓度很低，一般不超过1ppm，但由于它在工业中被广泛利用，煤炭，石油等燃料中也含有一定量的汞，同时，它也是某些农药的成份。随着工业废水的排放，
18、农药的应用和煤炭，石油的燃烧，汞被不断地引入自然环境。通过生物对它的富集作用和它的高毒性可以造成严重的危害。,主要的汞矿是硫化物，HgS俗称朱砂；溶解性极低，在厌氧环境中一般无变化，通气条件下HgS发生氧化作用，这可能是由于硫杆菌属的细菌作用，形成了Hg2+。可溶性Hg2+是很毒的，但很多细菌能行解毒作用，使其转化成元素汞：Hg0。,有些细菌能将Hg2+转化成甲基汞和二甲基汞，实验室内，芽孢杆菌属，梭菌属，分枝杆菌属和假单孢杆菌属的细菌，以及曲霉属、脉孢霉属的真菌和酵母菌都能引起甲基化作用。甲基化与辅酶维生素B12的作用分不开，其转化过程如下：,Hg0+CH3-B12,CH3-Hg+,(甲基汞
19、),CH3-Hg+ + CH3-Br,CH3-Hg-CH3,(二甲基汞),甲基汞和二甲基汞都是亲脂性的，生物摄取后，多富集于细胞的脂类物质中。甲基汞的毒性比汞Hg+或Hg2+大100倍，神经毒素，在水体中较多地富集于鱼类和贝类中，人食用了含汞的鱼、贝以后，可引起脑细胞的破坏而死亡。利用细菌消除汞污染,Chakrabarty把抗汞质粒转移到恶臭假单孢菌中，在含5070g/ml HgCl2的培养液中，该菌仍能生长，并将离子汞转化成Hg0。日本用汞细菌吸收并将含汞废水中的甲基汞、乙基汞、硝酸汞、乙酸汞和硫酸汞等水溶性化合物成元素汞，然后收集菌体，用活性炭吸收菌体内蒸发的一部分元素汞，另一部分沉淀在反
20、应器的底部的汞可以回收。金属汞的回收率可达80以上。,甲基汞的毒性比无机汞高50100倍。19531961年日本流行的水俣病(2200人患病，750人死亡)，即因该地渔民长期食用含甲基汞的鱼类所致。在好氧和厌氧条件下都能进行甲基化，但是甲基化速率在厌氧条件下要比在好氧条件下快得多。有多种微生物都能使汞甲基化，但是起主要作用的是硫酸还原菌。甲基传递体甲基钴铵素(CH3CoB12)将其上的甲基交给Hg2+变为甲基汞，并生成还原型钴胺素(H2OCoB12+)。其过程为：CH3CoB12+ Hg2+H2O CH3Hg+H2OCoB12+CH3CoB12+CH3Hg+H2O (CH3)2Hg+H2OCo
21、B12+,图6.2-1汞在自然界的循环,2.砷的污染和微生物转化砷是非金属元素，在自然界主要以氧化物(如白砷石As2O3，)和硫化物(如雄黄As4S4，雌黄As2S3)存在。 砒霜，即三氧化二砷 三氧化二砷为白色晶体，微溶于水。溶于水后生成亚砷酸(H3AsO3)亚砷酸离子(3+)比砷酸(H3AsO4)离子(5+)更毒。具挥发性的三甲基砷也对人体有毒害作用。,砷能使人与动物的中枢神经系统中毒，使推动细胞代谢作用的酶系失去作用，还发现它具有致癌作用。 污染环境的砷化合物的来源是多方面的：农药和染料：亚砷酸盐和有机砷化物被用作原料，一些含磷酸盐的洗涤剂中也含有少量砷,微生物对砷的作用,甲基化： 如土
22、生假丝酵母、粉红粘帚霉和青霉能使单甲基砷酸盐和二甲基砷酸盐形成三甲基砷。有些甲烷细菌能利用砷酸盐生成甲基砷。许多微生物能将污水和污泥中的砷转化成三甲基砷。,例如： 砷化物加到颜料中可使色彩特别鲜艳，因而早被采用。许多年前，用含砷颜料墙纸装饰的房间里，曾发生人中毒死亡事件。后经研究证实，致命因子不是颜料本身，而是在墙纸上生长的霉菌的代谢产物三甲基砷一种挥发性的、有大蒜气味的剧毒物质。土壤里也会发生这种砷的转化和挥发作用，所以农田中施用含砷化物的杀虫剂和除草剂，对人体可能存在潜在的危害。,参与形成三甲砷的微生物很多，真菌最为普遍，有帚霉、曲霉、毛霉、镰孢、青霉等属中的一些种，还有土生假丝酵母、粉红
23、黏帚霉等；细菌有厌氧细菌甲烷杆菌属和普通脱硫弧菌。微生物生成甲基砷的可能途径如下：,三甲砷在常温常浓度通气条件中不易氧化，比较稳定。在门窗紧闭空气不流通的室内，含砷糊墙纸上霉菌所产生的含砷毒物有时可达致死浓度，即使在开放系统中也是如此。据报道，在某施用含砷农药的林区，大蒜样砷味甚浓，该地工作人员的血和尿中含砷量均高。氧化为砷酸盐： 如无色杆菌、假单孢菌、黄杆菌、节杆菌和产碱杆菌能将亚砷酸盐氧化为砷酸盐；还原成亚砷酸盐： 甲烷细菌，脱硫弧菌，某些微球菌在厌氧条件下又能将砷酸盐还原成毒性更强的亚砷酸盐。,4. 硒的生物转化 （1） 硒的毒性硒是细菌、温血动物的必需元素，它又是剧毒元素，需要量与中毒
24、量差距不大。在植物含硒丰富的地方，牛、羊、猪、马等家畜常发生中毒，甚至死亡。微生物通过转化作用可改变元素硒的毒性。光合紫色硫细菌把元素硒氧化为硒酸盐，毒性增强。土壤中大部分细菌、放线菌和真菌都能发生还原作用，如假丝酵母、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌、小球菌属、根瘤菌属及氧化亚铁硫杆菌能将硒酸盐还原为元素硒，使其毒性减弱。这种还原成硒的作用很容易鉴别，因为生成的元素硒存于菌体内，呈现鲜明的红色，使菌落为砖红色。,微生物能把元素硒和无机或有机硒化物转化成二甲基硒化物，毒性明显降低。具有甲基化作用的真菌有黑曲霉、青霉、短柄帚霉、假丝酵母等，细菌有棒状杆菌、气单胞菌、黄杆菌、假单胞菌等。植物体内的有机硒可被
25、微生物矿化为硒酸盐和亚硒酸盐。微生物通过解毒代谢排出的有机金属化合物，可能比原型态对高等生物具有更大的危害性。但微生物也可以把化合态金属还原为单质，这种转移方式可暂时或永久地将金属从与生物接触的环境中清除出去。,（2）硒的甲基化硒是硫族中的一个元素，具有与硫相似的生化性质。硒是生物必需的微量元素，缺硒会引起疾病，如地方病大骨节病、克山病都与缺硒有关。但是，硒又是毒物，甚至在较低浓度下就会有很强的毒性。动物饲料中硒含量少于0.030.1mg/kg时动物会得白肌病，超过5mg/kg时会引起中毒。维生素E与硒有密切关系，它们之间常起协同作用。饲料中如同时缺乏维生素E和硒会引起动物急性肝坏死；缺乏维生
26、素E但是有硒时症状较轻。,自然界的硒以硒酸盐、亚硒酸盐、元素硒、硒化物及有机硒化合物等形式存在。土壤及湖底泥中的一些无机及有机硒化物能经微生物转化生成稳定性的二甲基硒(CH3)2Se，然后释放到空气中去。如果碳源充足，则更促成(CH3)2Se的生成与挥发，二甲基硒的毒性较弱。,从无机硒化物产生(CH3)2Se的真菌有裂褶菌、假丝酵母、短柄帚霉、头孢霉、镰孢霉、青霉中的某些种，细菌有棒杆菌属、气单胞菌属、黄杆菌属及假单胞菌属中的某些种。真菌使硒化物甲基化的生化过程如下：,5.锡的甲基化无机锡基本上不具毒性，但甲基锡具有很高的毒性。例如三甲基锡在很低浓度下就可以造成不可逆转的神经损伤和神经坏死，它
27、可以从胃、肠道甚至从皮肤吸收。沉积物中的微生物和纯培养的许多微生物种可以将无机锡转变为一甲基锡、二甲基锡和三甲基锡，而灭菌的沉积物不能形成甲基锡，因此说明这个过程是一个微生物过程。,6.镉的生物转化细菌如大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌，真菌如黑曲霉在有Cd。+的环境中生长时，能积累大量镉。微生物也能使镉甲基化，一种能使锡甲基化的假单胞菌在有维生素B，z时，能把无机Cd2+转化成微量的挥发性镉化物，这种甲基化了的镉化物在水体中也可以通过烷基转移作用使汞甲基化生成甲基汞。,7.铅的生物转化从铅矿表面分离出来的节杆菌和生丝微菌，以及从煤渣中分离出来的一株梭状芽孢杆菌可溶解PbO和PbS04。铅也可以被细菌
28、甲基化。纯培养的假单胞菌、产碱杆菌、黄杆菌和气单胞菌，能将三甲基醋酸铅转化为四甲基铅，但不能使无机铅化物进行转化。湖泊的“水一沉积物”系统在无氧条件下，也可生成四甲基铅。,（三）微生物对重金属的抗性机制为了应对环境中的重金属元素对细胞的毒害，微生物通过多种机制抵御重金属的毒性并对其去毒。抗性机制大抵分为两类：通用机制可以抗多种金属，并且还有其它的功能，如荚膜或粘液层除金属抗性功能外还有保护功能；专性机制只对某种金属起作用，而且有些需要金属诱导。,1通用机制微生物的胞外物质可以和金属结合防止其进入细胞。细胞表面有大量的阴离子可以和多种阳离子(如镉、铅、锌和铁等)结合。例如，藻类表面含有羰基、氨基
29、、巯基、羟基都有结合金属的倾向。细菌细胞外的黏液层上磷酰基和磷脂也与阳离子有很强的作用。真菌也有此功能。,(1)细菌胞外聚合物 细菌胞外有荚膜或黏液层可产生多种胞外聚合物，如多糖、蛋白质和核酸，但主要以多种杂合多聚体形式存在，如糖蛋白、脂多糖等。这些多聚体一般带负电荷，可以与铅、镉和铀这样的金属结合，其效能与pH有关。如金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、固氮菌属等多种细菌的胞外聚合物可以固定金属铅，这是最为常见的抗铅机制。,(2)铁载体又称嗜铁素、铁螯合剂，是一种存在于胞外的低分子量化合物，它可以富集环境中低浓度的铁并促进其转移到细胞中。铁载体还可以和与铁性质相似的金属作用，如与镓、铬和铝等，降低这
30、些金属的有效性从而降低了毒性。蓝细菌和藻类也有铁载体及其类似物，如没有铁可以络合铜元素等。鱼腥蓝菌属产生铁载体可和铜络合，从而保护细胞不受铜毒害。,(3)生物表面活性剂有许多微生物在某些情况下可以分泌这类物质与金属镉、铅和锌等络合。这种络合实际上增加了金属的表观溶解度但是络合金属却不会对活细胞有毒害作用。(4)细胞代谢产物 在细胞表面细胞代谢产物与金属结合形成磷酸盐和金属硫化物沉淀。柠檬酸杆菌属可以促进磷酸镉、磷酸铅、磷酸铀沉淀。在厌氧条件下，硫酸还原菌如脱硫弧菌可以使金属沉淀。,2专性机制(1)金属硫蛋白蓝细菌（MT）、细菌、微细藻类和丝状真菌，以及植物均有金属结合蛋白。它富含半胱氨酸的短肽
31、，对镉、铜、锌、银和汞的重金属有高度亲和性。金属诱导金属硫蛋白的产生，其作用主要是去毒。蓝细菌聚球蓝菌、大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌都有MT。酿酒酵母由铜诱导产生MT，并形成Cu-MT结合物。MT及其类似物还可以与Zn、Ag、Co和Au结合，但这些金属元素一般不能诱导MT合成。,(2)植物螯合肽是小分子的半胱氨肽Y一谷氨酰肽。藻类和植物以及一些真菌和酵母也含有。酿酒酵母不能合成植物螯合肽，但是粟酒裂殖酵母在与重金属接触的情况下至少合成7种不同的同源的Y-谷氨酰肽。这些金属有Cd、Cu、Pb、Zn和Ag，其中以Cd最重要。(3)金属出流系统 有些微生物依赖质粒编码的需能的金属外流系统去除进入细胞的
32、金属。有些外流系统要ATP酶，有些靠化学渗透离子质子泵。这些机制通过主动转运系统(ATP酶)或扩散作用(渗透离子质子泵)可以有效地泵出已经进入细胞内的有毒离子。,许多细菌对砷酸盐的抗性与酶使砷酸盐还原以及亚砷酸外流有关(图6.2-2)，砷酸盐先还原为亚砷酸盐，然后亚砷酸盐外流。革兰氏阳性和革兰氏阴性均如此。革兰氏阴性的大肠埃希氏菌是两个组分的膜结合ATP酶复合体，ArsA和ArsB分别对亚砷酸盐从细胞内外流起作用。ArsC是一个需要NADPH的细胞质蛋白，与还原砷酸盐为亚砷酸盐有关。,革兰氏阳性菌没有ArsA蛋白。镉是另外一类金属外流系统(图6.2-3)。镉的毒性主要是镉与蛋白质中的巯基结合并
33、使单链DNA断裂。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、富养罗尔斯通氏菌、大肠埃希氏菌、恶臭假单胞菌以及蓝细菌、真菌、藻类均有抗镉机制。革兰氏阳性菌的抗镉作用是使用ATP介导的外流泵，革兰氏阴性菌是依靠化学渗透反向转运泵。,图6.2-2微生物抗砷机制示意图示砷外流和内流系统,砷酸盐通过磷酸盐特异转移途径进入细胞，在细胞内砷酸盐被还原为亚砷酸盐，亚砷酸盐通过阴离子泵和ATP酶被泵到细胞外。,图6.2-3微生物抗金属机制示意图示镉外流和内流系统 镉通过锰转移途径进入细胞(依靠膜电位)，镉又通过外流系统经Cd2+/2H+反向转移被排到细胞外。,（四）微生物金属转化作用污染控制中的利用不管是对重金属污染土壤和
34、沉积物生物修复也好，还是对重金属污染的水生物处理也好，采取的策略主要有两种：将重金属在原位固定以降低其有效性，或将重金属去除出去。,1.固定的方法（1） 硫化物沉淀法 硫酸盐还原菌，如脱硫弧菌能把SO42-还原成H2S，H2S很容易与Hg、Zn、Cd、Cu、Fe和Pb形成不溶性的化合物。在泥污床反应器中生长脱硫弧菌，可以有效地处理受重金属和硫酸盐污染的地下水，这些微生物生长的底物为乙醇。加入硫酸盐、提供厌氧条件和有效碳源(发酵的糖蜜)产生H2S并使Cr6+还原，这种方法已在现场试验中使用修复铬污染的浅水层。铬有Cr6+和Cr3+两类，Cr6+毒性和水溶性都强，Cr3+毒性和水溶性都低，在土壤中
35、移动性差。所以通过还原作用可以使Cr的毒性和移动性降低。,（2） 磷酸盐沉淀法 柠檬酸杆菌的静止细胞表面上存在酸性磷酸酶，司以催化有机磷酸释放出磷酸盐，并使二价阳离子发生沉淀反应，所形成的沉淀物累积于细胞表面上。根据这个原理可以利用这种细菌处理含有重金属或放射性物质污水。但是处理的污水必须含有有机磷酸化合物。沉淀法铀生物修复是使用磷酸三丁酯作为铀萃取剂，然后通过混合培养降解磷酸三丁酯释放出磷酸，磷酸和铀结合成磷酸双氧铀沉淀。,2.生物吸附去除方法 （1） 生物吸附利用微生物吸附溶液中的贵金属、稀有金属及有毒金属，是近年来兴起的一门新兴技术，既可用于冶金领域，也可用于环保工程。原理是微生物细胞壁
36、中含有的多糖、糖蛋白、脂多糖等多聚物带有很多的负电荷基团，常常可以将与其代谢必须的矿物离子具有同量电荷的金属离子吸附到自己的细胞壁上，使金属得以富集。所用的微生物既可以是活菌，也可以是死菌。如链霉菌、假单胞菌和节杆菌可以选择性的吸附铀；芽孢杆菌和曲霉等可吸附锌。,例如把藻类和蓝细菌微生物装在一个空心柱中利用吸附可以降低矿山出水中Cu、Cd、Zn、Hg和Fe的浓度，重金属的去除率可达99。真菌(包括酵母菌)是许多发酵工业的副产物，它们的细胞壁具有吸附和累积重金属的能力。这些细胞经过碳酸盐或洗涤剂处理后，有利于吸附污水的重金属。含有铀的废液通过与生物量(固定化的少根根霉菌体、残留的酿造酵母)接触去
37、除铀。,（2） 转变金属元素利用抗汞微生物的特性，将含汞化合物转变为金属汞。日本提出利用微生物吸收含汞废水中的甲基汞、乙基汞、硝酸汞、乙酸汞和硫酸汞等水溶性汞化物，使之还原成元素汞，然后收集菌体，将菌体元素汞一部分蒸发，用活性炭吸收，另一部分汞沉淀在反应器底部加以回收，元素汞的回收率可达80以上。,三、污染环境的生物修复,（一）概述,1. 生物修复技术的基本概念生物修复技术是1980年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，主要是利用生物特有的分解有毒有害物质的能力，去除污染环境如土壤中的污染物，达到清除环境污染的目的。在该技术的萌芽阶段，主要应用于环境中石油烃污染的治理，并取得成
38、功。实践结果表明，生物修复技术是可行的、有效的和优越的，此后该技术被不断扩大应用于环境中其他污染类型的治理。欧洲各国如德国、丹麦、荷兰对生物修复技术非常重视，全欧洲从事该项技术的研究机构和商业公司大约有近百个，他们的研究证明，利用微生物分解有毒有害物质的生物修复技术是治理大面积污染区域的一种有价值的方法。,生物修复是采用诸如提高通气效率、补充营养(对石油污染而言，主要是补充N、P)，投加优良菌种、改善环境条件等办法来提高微生物的代谢作用和降解活性水平，以促进对污染物的降解速度，从而达到治理污染环境的目的。生物修复技术最成功的例子是Jon EL1idstrom等人在1990年夏到1991年应用投
39、加营养和高效降解菌对阿拉斯加Exxon Valdez王子海湾由于油轮泄漏造成的污染进行的处理，取得非常明显的效果，使得近百公里海岸的环境质量得到明显改善。,随着近年来生物修复技术的飞速发展，生物修复的内涵在不断丰富，开发了许多新的或改良的生物技术。生物修复可以分为微生物修复、植物修复、动物修复和生态修复四大类，其中微生物修复就是我们通常所称的狭义上的生物修复。,2.应用生物修复技术应具备的条件在解决实际污染问题时，应用微生物修复技术必须具备以下条件：存在具有代谢活性的微生物；降解过程不产生有毒副产物；污染环境中的污染物对微生物无害或其浓度不影响微生物的生长；目标化合物必须能被微生物利用；处理场
40、地利于微生物的生长；处理费用较低，至少要低于其他处理技术。,3.生物修复技术的特点与化学、物理处理方法相比，生物修复技术具有下列的优点：污染物在原地被降解清除；修复时间较短；操作简便，对周围环境干扰少；费用少，仅为传统化学、物理修复经费的3050；人类直接暴露在这些污染物下的机会减少；不产生二次污染，遗留问题少。,根据不同环境的污染特点，近年来研究开发出以微生物为主，联合植物，并配合物理、化学措施的综合修复技术。例如，降解微生物与植物联合修复技术，电化学强化生物修复技术等。菌根是高等植物营养根系与真菌菌丝共同形成的一种联合体，二者属互利的共生关系；菌根真菌在植物根系数量远高于根外土壤，其旺盛生
41、活不仅改善植物营养，而且能降解植物根际的某些污染物。,20世纪90年代以来，根际菌根生物修复技术作为一项新的生物修复技术，已成功应用于石油、多环芳烃、农药等有机污染的治理中。可以说，生物修复已发展成为一种新的可靠的环保技术并得到广泛应用，有人称之为生物处理技术的一个里程碑。目前在生物修复领域中广受重视的几个研究方向是：研究微生物群体结构及其对环境变化的反应动力学；分析污染物的有氧和厌氧降解生化机理；通过遗传学手段改造菌株以提高其降解能力；对新的生物修复技术进行微观及中试研究，考察其实施费用及应用的可行性。,（二） 生物修复技术的原理 1.污染环境微生物的修复原理污染环境微生物的修复和废水、废物
42、生物处理的原理都与环境微生物自净原理十分相似。污染环境微生物修复实在人为干预下，使环境中的微生物群落和理化条件更有利于提高污染环境中微生物活性的情况下进行，因此比自净作用净化速率高得多。污染环境微生物修复是通过单独或同时改变微生物群落的特性和环境理化条件而得以实现的，其方法有：,生物促进法，即利用环境中固有微生物群落，通过改善环境条件提高微生净化速率；生物强化法，这类方法是将主要污染物有特效净化作用的微生物引入污染环境，从而提高净化效果，它对受难降解有机物有毒物质为主要污染物污染的环境的修复具有特效作用；生物促进法与生物强化法联合应用。,2.修复中起作用的微生物在污染环境修复中起作用的微生物与
43、污染物的类型有关。就其来源而言，可以将其分为两大类，即土著微生物和外来微生物。,（1） 土著微生物土著微生物即受污染环境中固有的微生物，事实上当某一环境受到污染后，其物理化学特性就发生了变化，环境中的微生物群落在新环境的压力和选择下，会发生变化。微生物群落的变化常有：根据自然淘汰理论发生的适者生存发展，严重不适者消亡，即群落中的优势种和组成种群发生变化；根据遗传学理论发生的某些个体的变异，形成具有新特性的种群。因此，其中的微生物是一个变化了的微生物群落，一个对污染环境适应性更强的微生物群落，一个对污染物净化能力更强的微生物群落。但其中的每个微生物种群都源自受污染环境原有的微生物。,（2） 外来
44、微生物由于污染环境中往往存在着限制微生物代谢活性和净化能力的因素，使净化作用难以快速进行，所以加入外来有效微生物是提高净化速度的重要方法。所谓外来微生物一般指人为加入的特效微生物，它们都是人为选育的、具有特殊功能的微生物制剂，如能快速降解难降解有机物和有毒有机物质，使之无害化等。这类微生物可通过以下途径获得：,从自然环境、污染环境或生物污泥中筛选出来，经驯化的特效微生物；取自自然界的菌种，经物理、化学法诱变后筛选出来的优秀菌；基因工程菌。以上具有特殊功能的微生物，在应用中都必须考虑：特殊功能菌对使用环境的适应性；特殊功能菌是否能在使用环境中优势生长；在使用环境中能否对目标污染物进行快速净化；基
45、因工程菌还必须充分注意在使用环境中的安全性。,3.影响生物修复的环境因素影响微生物生长、活性及存在的因素很多，包括物理、化学及生物因素。这些因素影响微生物对污染物的转化速率，也影响生物降解产物的特征及持久性。污染现场环境条件的多样性对微生物降解作用影响是巨大的。（1）非生物因素影响 有机物生物降解性最主要的环境因素有温度、湿度、pH值、溶解氧、营养物质、无机盐分以及有毒物质等。 ,（2） 营养物质微生物的生长除需要有机物提供的碳源和能源之外，还需要一系列营养物质和电子受体。如氮、磷、生长因子等物质的加入会刺激微生物的生长，促进污染环境的修复。（3） 共存物质 自然环境或污染环境下经常是多种基质
46、在一起，多种微生物和多种化合物共存下的生物降解于一种微生物对一种化合物的生物降解有很大不同。往往受环境因子和生物因子等因素的影响出现多种情况，如多种基质可以同时被利用、一种基质促进另一种基质的降解速率、一种基质减慢另一种基质的降解等情况，但多数缺少实验证据。,（4） 电子受体 环境中污染物氧化分解的最终电子受体的种类和浓度也影响着污染物生物降解的速度和程度。微生物氧化还原反应的最终电子受体主要分为三类，包括氧、有机物分解的中间产物和无机酸根(如硝酸根、硫酸根等)。好氧条件有利于大多数污染物的生物降解，可采用一些工程化的方法来增加土壤中的氧，如布设地下通气管道压送空气；向土壤中添加产氧剂，通常是
47、双氧水(H2O2)，其浓度在100200 mgL时对微生物没有毒性效应。,（5） 微生物的协同作用 许多生物修复需要多种微生物的合作，这种合作在最初的转化反应和以后的矿化作用中都可能存在。协同有不同的类型，一种情况是单一菌种不能降解，混合以后可以降解；另一种情况是单一菌种都可以降解，但混合以后降解的速率超过单个菌种的降解速率之和。协同作用主要表现为：一种或几种微生物向其他微生物提供生长因子；一种微生物可对某种有机物进行不完全降解，第二种微生物则使前者的产物矿化；一种微生物只能共代谢有机物形成不能代谢的产物，另一种微生物则可以分解这些产物；一种微生物产生的产物对自身有毒害作用，但另一种微生物可以
48、解除这种毒害，并将其作为碳源和能源利用。,（6） 生物间的相互作用 环境中存在的生物之间通过共生、互生、捕食、寄生等关系，相互影响，相互作用。微生物之间的共生和互生常促进生物降解作用，捕食和寄生限制微生物的增长，从而影响污染物的生物降解过程。此外，植物根际微生物对污染物的生物降解有促进作用，种植植物有利于生物修复的进行。,4. 污染土壤的生物修复污染土壤环境的生物修复主要有原位生物处理和异位生物修复两类方法。 （1） 土壤原位生物处理原位生物处理是在受污染地区直接利用土壤中固有的微生物净化污染物，使土壤的理化特性、生物学特性和功能得到恢复的技术。该技术不需要将土壤挖出和运输，一般采用土著微生物
49、处理，有时也加入经过驯化和培养的微生物以加速处理进程。,土地处理 天然土壤中存在丰富的微生物种群，具有多种代谢活性，因此处理污染物的一个简单方法是依靠土著微生物的作用将污染物分解或去除，这种方法称之为土地处理，它应用于石油工业废弃物处理已有多年的历史，也被用于处置多种类型的污泥、石油气厂的废弃物、含防腐油土壤及各类工业废弃物，如食品加工、纸浆及造纸、鞣革业等的废弃物。土地处理对于石油及石油制品污染土壤的处理效率已被实验室内精确控制的实验及实际处理实践所证实。如汽油、喷气燃料及加热用油内的碳氢化合物在用肥料、石灰处理过且模拟耕种过的土壤中浓度大幅度降低。又如在对某120m2被污染耕种土壤的研究中，发现经过15个月的生物修复，石油浓度降低80。,
