1、福建森宝食品集团股份有限公司企业标 准 Q/JCWI 0214 2013 动物性食品中“ QNS-SQX”二合一药物残留检测 酶联免疫吸附法 2013 - 08 - 01 发布 2013 - 08 - 01 实施 福建森宝食品集团股份有限公司 发布 Q/JCWI 0214 2013 1 前 言 本标准按照 GB/T 1.1标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写给出的规则起草 本标准由公司检测中心提出并审核 本标准起草单位：检测中心 本标准起草人： 张超红 本标准批准人： 黄金兰 本标准于 2013年 8月 1日首次发布。 Q/JCWI 0214 2013 2 修改履历表 版本 章节 条款
2、 修改内容或记录号 修改人 （起草人） 批准人 修改日期 （发布日期） 实施日期 A/0 全新发布 张超红 黄金兰 2013.8.1 2013.8.1 Q/JCWI 0214 2013 3 动物性食品中“ QNS-SQX”二合一药物残留检测 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物可食性组织中 氟喹诺酮类、 磺胺喹噁啉 药 物残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法。 本标准适用于猪肌肉、鸡肌肉 氟喹诺酮类、 磺胺喹噁啉 药 残留量的测定。 2 试验原理 试剂盒采 用竞争 ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氟喹诺酮类药物、磺胺喹噁啉 和相对应的酶标板微孔条上预包被的
3、偶联抗原竞争抗氟喹诺酮类药物或抗 磺胺喹噁啉 抗体，加入酶标二抗后，用 TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物氟喹诺酮类药物或 磺胺喹噁啉 的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中氟喹诺酮类药物或 磺胺喹噁啉的残留量 。 3 交叉反应率 3.1 氟喹诺酮类药物交叉反应率 诺氟沙星 100% 双氟沙星 84% 恩 诺沙星 100% 氟甲喹 126% 沙拉沙星 107% 达氟沙星 110% 培氟沙星 146% 环丙沙星 110% 依诺沙星 66% 氧氟沙星（消旋体） 58% 左氧氟沙星 10% 噁喹酸 28% 洛美沙星 4% 麻保沙星 4% 3.2 磺胺喹噁啉 交
4、叉反应率 磺胺喹噁啉 100% 磺胺二甲基嘧啶 3.2% Q/JCWI 0214 2013 4 磺胺甲基嘧啶 1.1% 磺胺甲氧哒嗪 3.4% 磺胺甲基异噁唑 0.9% 磺胺间甲氧嘧啶 0.8% 磺胺噻唑 0.55% 4 设备及试剂 以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合 GB/T 6682规定的二级水 。 4.1 设备 微孔板酶标仪 450/630nm 旋转蒸发仪 /氮气吹干装置 均 质器 涡旋仪 离心机 天平：感量 0.01g 刻度移液管 ： 10ml 洗耳球 容量瓶： 500ml 聚苯乙烯离心管 ： 2 ml 、 50ml 微量移液器：单道 20 200l、 100 1000
5、l 多道 250l 4.2 试剂 乙腈 (分析纯 ) 正己烷 (分析纯 ) 去离子水 5 试剂盒提供的材料与试剂 5.1 96 孔酶标板 1 块 （ 氟喹诺酮类） 96孔酶标板 1块 （ 磺 胺喹噁啉 ） 5.2 标准 品 6 瓶：（ 2ml/瓶） 0ppb， 0.5ppb， 1.5ppb， 4.5ppb， 13.5ppb， 40.5ppb 5.3 高浓度标准品：（ 2ml/瓶） 1ppm 5.4 酶标二抗浓缩液 2ml 5.5 抗体工作液 15ml 5.6 底物液 A 液 15ml Q/JCWI 0214 2013 5 5.7 底物液 B 液 15ml 5.8 终 止 液 15ml 5.9
6、20浓缩洗涤液 40ml 5.10 4浓缩复溶液 50ml 6 溶液的配制 配液 1: 复溶工作液 （用于组织样本 复溶 ） 用去离子水将 4浓缩 复溶 液 按 1： 3体积比进行 稀释（ 1份 4浓缩 复溶 液 +3份去离子水） 用于样本的复溶 。 复溶 工作液在 4 （ 39.2 ）环境可保存一个月。 配液 2:洗 涤工作液 用去离子水将 20浓缩 洗涤液 按 1： 19体积比进行稀释 （ 1份 20浓缩 洗涤液 +19份去离子水） 用于酶标板的洗涤， 洗涤 工作 液在 4 （ 39.2 ） 环境可保存一个月。 7 样本前处理步骤 7.1 处理任何样本时，都必须注意： a) 实验中必须使用
7、一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 b) 实验之前须检查各种实验器具是否 洁 净， 必须使用洁净 实验器具，以避免污染干扰实验结果。 7.2 样本前处理方法 称取 2.00.05g 均质 后的组织样本至 50ml 聚苯乙烯离心管 中， 加入 8ml 乙腈，用振荡器振荡5min，混匀， 3000g 室温（ 20-25 /68-77）离心 5min； 移取 2.5ml 上层有机相至 10ml 洁净干燥玻璃试管中， 于 50-60（ 122-140）水浴氮气流下吹干； 加入 1ml 正己烷，用涡旋仪涡动 1min，再加入 1ml 复溶工作液 (见配液 1)用涡旋仪 涡动 30s，混匀， 30
8、00g 室温 （ 20-25 /68-77）离心 5min； 除去上层有机相，取下层水相 50l 用于分析。 8 检测步骤 8.1 测定前应须知： 8.1.1 使用之前将 模具内所有试 剂与酶标板放实验桌回温 至室温（ 20-25 /68-77 ） 。 8.1.2 使用之后立即将所有试剂放回 2-8 （ 36-46） 。 8.1.3 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。 8.1.4 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 8.2 操作步骤： Q/JCWI 0214 2013 6 8.2.1 将所需试剂从
9、冷藏环境中取出，按照上述方法进行回温，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 8.2.2 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于 2-8 （ 36-46）环境中。 8.2.3 浓缩洗涤液和浓缩复溶液在使用前也需按上述方法回温。 8.2.4 编号： 将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 8.2.5 加标准品 /样本： 加标准品 /样本 50l 到对应的微孔中。 8.2.6 抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合： 将抗体工作液和酶标二抗浓缩液按 10:1 体积比混合并混匀。（注：此混合液不能保存，混合均匀后立刻进行加样）
10、 。 8.2.7 加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液： 加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液 50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板模盖板后 置 25（ 77 ） 避光环境中反应 30min。 8.2.8 洗板： 小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液 （见配液 2） 250l/孔，充分洗涤4-5 次，每次间隔 10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干 （拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破） 。 8.2.9 显色： 加入底物液 A 液 50l/孔，再加入底物液 B 液 50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25（ 77 ） 避光环境中反应 15min（见注意事项 8）。 8.2
11、.10 测定： 加入终止液 50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630nm检测，请在 5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。 (若无酶标仪， 则不加终止液用目测法可进行判定 )。 9 结果判定 9.1 氟喹诺酮类药物结果判定 氟喹诺酮类药物 结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1种方法，定量判定用第 2种方法。注意样本吸光 度 值与 其所含氟喹诺酮 类的含量成负相关 。 9.1.1 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围 (ppb)。 假设 样本 1 的吸光度值为0.501，样本 2 的吸光度 值为 0.912，标准品吸光度值分别是：
12、 0ppb 为 1.792； 0.5ppb 为 1.407； 1.5ppb为 1.159； 4.5ppb 为 0.641； 13.5ppb 为 0.245； 40.5ppb 为 0.111。则样本 1 的浓度范围是4.5ppb-13.5ppb 再 乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中氟喹诺酮类药物残留的浓度范围 ；样本 2 的浓度范围是 1.5ppb-4.5ppb再 乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中氟喹诺酮类药物残留的浓度范围 。 9.2 磺胺喹噁啉 结果判定 磺胺喹噁啉 结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1种方法，定量判定用第 2种方法。注意样本吸光度 值与 其所含 磺胺喹噁啉 的含量
13、成负相关。 9.2.1 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围 (ppb)。 假设 样本 1 的吸光度值为0.301，样本 2 的吸光度 值为 0.901，标准品吸光 度值分别是： 0ppb 为 2.069； 0.5ppb 为 1.619； 1.5ppb为 0.980； 4.5ppb 为 0.384； 13.5ppb 为 0.126； 40.5ppb 为 0.035。则样本 1 的浓度范围是Q/JCWI 0214 2013 7 4.5ppb-13.5ppb 再 乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中 磺胺喹噁啉 残留的浓度范围 ；样本 2 的浓度范围是 1.5ppb-4.5ppb 再
14、 乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中 磺胺喹噁啉 残留的浓度范围 。 9.2.2 定量分析 1) 百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的 平均 吸光度值（双孔）除以第一个标准 品 （ 0 标准）的 平均 吸光度值，再乘以 100%，即 B 百分吸光 率 （ %） 100% B0 B 标准 品 或样本溶液的平均吸光度值 B0 0ppb标准溶液的平均吸光度值 2) 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以 氟喹诺酮类药物或 磺胺喹噁啉 标准品浓度（ ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度， 乘以
15、其对应的稀释倍数即为样本中 氟喹诺酮类药物或 磺胺 喹噁啉 的实际浓度 。 样本稀释倍数 组织样本稀释倍数： 2 倍 10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 试剂盒灵敏度： 0.5ppb 样本最低检测限： 组织 1ppb 10.2 准确度 ： 组织 90% 20% 10.3 精密度： 试剂盒的板内、板间变异系数均小于 10% 。 11 注意事项 11.1 室温低于 20 （ 68） 或试剂及样本 的温度 没有回到室温（ 20-25 /68-77 ）会导致所有标准的 OD 值偏低。 11.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象 。所以洗板拍干后
16、应立即进行下一步操作。 11.3 每加一种试剂前需要将其摇匀 。 11.4 反应终止液为 高浓度 硫酸，避免接触皮肤。 Q/JCWI 0214 2013 8 11.5 不要使用 超出 有效期的试剂盒 ；也不要使用超出有效期的试剂盒中的任何试剂，掺 杂使用 超出有效期的试剂盒 会引起灵敏度的降低 ； 不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 11.6 储存条件 保存试剂盒于 2-8 （ 36-46） ，不要冷冻，将不用的微孔板放 回铝箔袋 重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 11.7 试剂变质的迹象 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。 0标准 品 的吸光度（ 450/630nm）值小于 0.5 （ A450nm0.5 ）时，表示试剂可能变质。 11.8 在加入 底物液 A 液和底物液 B 液 后，一般显色 15min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 20min（或更长），但不得超过 30min。反之，则减短反应时间。 11.9 该试剂盒最佳反应温度为 25 （ 77） ，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化 会直接影响检测结果 。 12 贮藏条件及保存期 贮藏条件：保存试剂盒于 2-8 (36-46 )环境中。 保存期：该产品有效期为 12个月。 _
