1、不同厂家银杏叶提取物制剂对家兔血小板聚集率及PAF含量的影响徐露 董志 王如伟 黄黎 【摘要】目的 观察四个厂家的六种银杏叶提取物制剂对家兔血小板聚集率及PAF含量的影响。方法 采用体内实验，观察六种银杏叶提取物制剂对由花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）和血小板活化因子（PAF）诱导的家兔血小板聚集作用的影响，以及对给药前后家兔血小板活化因子（PAF）含量的影响。结果 几个厂家的银杏制剂均能抑制AA、ADP、PAF诱导的家兔血小板聚集（p0.01, p0.05），并能够降低血清中PAF的含量（p0.01, p0.05）。结论 银杏叶提取物制剂具有抗血小板聚集作用，并能显著降低PAF含量，
2、不同厂家的银杏制剂作用强度也存在差异性，为临床治疗缺血性心脑血管疾病提供了参考。银杏叶具有重要的药用价值，到目前为止已知其化学成分的银杏叶提取物多达160余种，最主要的是黄酮苷和银杏内酯两类活性成分，药理实验表明，银杏提取物具有抗氧化、改变血液流变学、抗菌及提高免疫力等作用。1. 材料与方法1.1仪器与试剂日本大耳白兔，体重2.00.2kg，雌雄各半，由重庆医科大学实验动物中心提供；银杏叶提取物制剂（浙江康恩贝、江苏省某药企、上海某药企A、上海某药企B）；AA（sigma）使用时将其溶解在1%碳酸钠溶液中，配成0. 35mmol/L的浓度；ADP（sigma）溶于磷酸盐缓冲液,最终浓度为300
3、mol/L；PAF（cayman）溶解在PH为7.6的含0.25%小牛血清蛋白的Tris-NaCl溶液中，终浓度为3.6nmol/L；枸橼酸钠（北京中杉金桥生物技术公司）蒸馏水配成3.8%的浓度；TYXN-96多功能智能血液凝聚仪（上海通用技术研究所研制）；兔血小板活化因子(PAF)ELISA试剂盒（Uscnlife）；酶标仪（spectra maxm2多功能酶标仪）。1.2方法1.2.1分组及给药方法日本大耳白兔133只，随机分为19组，每组7只：生理盐水组、浙江康恩贝三种银杏制剂a（批号090307）、b（批号090307）、c（批号081112）各自分为高剂量（41.06mg/kg）、中
4、剂量(20.53mg/kg)、低剂量(10.27mg/kg)，ig给药，每日三次，连续7d；江苏某药企银杏制剂（批号08071501）分为高剂量（41.06mg/kg）、中剂量(20.53mg/kg)、低剂量(10.27mg/kg)，ig给药，每日三次，连续7d；上海某药企A银杏制剂（批号080502） 分为高剂量(53.36mg/kg)、中剂量(26.68mg/kg)、低剂量(13.34mg/kg)，ig给药，每日三次，连续7d；上海某药企B银杏制剂（批号0852049）分为高剂量(41.07mg/kg)、中剂量(20.53mg/kg)、低剂量(10.27mg/kg)，ig给药，每日三次，连
5、续7d。以上各组中剂量均根据文献1由人体剂量换算为家兔等效剂量。1.2.2检测血小板聚集率及PAF含量每只动物首次给药前，耳缘静脉抽血1ml，室温放置2h取血清，检测给药前PAF含量。在第7d给药后1h，心脏取血7ml，分出1ml用于检测给药后PAF的含量，剩余6ml用3.8%枸橼酸钠1：9抗凝，800r/min离心10min，取上清得富血小板血浆（PRP），剩余部分3000r/min速度离心15min，取贫血小板血浆（PPP）。用PPP调节PRP，使PRP血小板数目在360109/L。测定并记录在不同诱导剂下1min、5min及最大血小板聚集率。血小板聚集率（%）=（对照组血小板聚集率-给药
6、组血小板聚集率）/对照组血小板聚集率1001.2.3统计方法血小板聚集率检测用生理盐水组与给药组比较，采用成组t检验；PAF含量检测采用给药前后自身对照，用配对t检验。2.2结果2.2.1家兔血小板聚集率的检测结果检测结果表明，和对照组相比四个药厂的六种银杏叶提取物产品均能抑制AA、ADP、PAF诱导的家兔血小板聚集（p0.05，p0.01），但主要是抑制PAF引起的血小板聚集。其中杭州某药业有限公司的a、b、c产品对PAF诱导的血小板聚集抑制率更高。（见表1-3）表一 AA诱导的血小板聚集作用（s,n=7)组别给药剂量 mg/kg给药次数（次/d）给药后聚集率（%）血小板聚集抑制率(%)1m
7、in5minMax 生理盐水组等容积330.125.2454.157.5655.699.84浙江康恩贝a产品（高）41.06328.684.9838.626.34*43.556.96*21.80浙江康恩贝a产品（中）20.53329.505.6340.666.53*42.807.13*23.15浙江康恩贝a产品（低）10.27330.745.7242.496.58*46.147.6217.15浙江康恩贝b产品（高）41.06327.154.5735.645.83*40.716.76*26.90浙江康恩贝b产品（中）20.53329.555.8937.226.07*43.347.01*22.18
8、浙江康恩贝b产品（低）10.27328.054.3438.416.44*44.287.93*20.50浙江康恩贝c产品（高）41.06328.694.4734.675.75*39.936.96*28.30浙江康恩贝c产品（中）20.53329.595.0436.936.29*42.266.48*24.12浙江康恩贝c产品（低）10.27330.245.3336.686.16*43.807.37*21.35江苏某药企（高）41.06330.755.4640.866.99*44.237.31*18.06江苏某药企（中）20.53330.115.8141.746.67*46.527.9716.47江
9、苏某药企（低）10.27329.435.7744.387.25*47.598.0614.54上海某药企A（高）53.36328.175.5140.346.56*44.737.68*19.68上海某药企A（中）26.68329.485.4842.526.83*45.857.3917.67上海某药企A（低）13.34330.095.4543.346.94*45.927.4417.54上海某药企B（高）41.06328.645.6140.796.70*42.857.02*23.06上海某药企B（中）20.53330.835.5341.287.46*43.608.01*21.71上海某药企B（低）10
10、.27329.125.3641.877.55*44.407.75*20.27与NS组比较，*p0.01,*p0.05表二ADP诱导的血小板聚集作用（s,n=7)组别给药剂量 mg/kg给药次数（次/d）给药后聚集率（%）血小板聚集抑制率(%)1min5minMax 生理盐水组等容积330.125.2454.157.5655.699.84浙江康恩贝a产品（高）41.06331.985.4740.477.06*44.597.45*20.42浙江康恩贝a产品（中）20.53331.435.3743.816.7945.317.86*19.13浙江康恩贝a产品（低）10.27330.855.8345.9
11、76.9847.327.9915.55浙江康恩贝b产品（高）41.06329.794.4634.835.93*40.176.78*28.31浙江康恩贝b产品（中）20.53330.885.5736.475.76*42.906.91*23.43浙江康恩贝b产品（低）10.27331.675.6939.826.27*45.068.13*19.58浙江康恩贝c产品（高）41.06330.515.4534.775.60*40.546.83*27.65浙江康恩贝c产品（中）20.53331.575.8635.486.31*43.737.22*21.95浙江康恩贝c产品（低）10.27330.755.70
12、37.546.48*45.918.3618.06江苏某药企（高）41.06330.665.5344.677.9445.457.56*18.88江苏某药企（中）20.53331.655.4345.957.9246.118.2417.70江苏某药企（低）10.27331.735.6046.188.3548.699.0513.10上海某药企A（高）53.36330.485.5843.297.4144.507.36*20.58上海某药企A（中）26.68331.815.8344.236.7945.968.6717.97上海某药企A（低）13.34329.424.8345.787.2649.049.37
13、12.48上海某药企B（高）41.06332.035.5942.336.95*44.637.84*20.35上海某药企B（中）20.53330.475.1344.827.5145.068.13*19.58上海某药企B（低）10.27330.515.4544.777.6047.298.2715.60与NS组比较，*p0.01,*p0.05表三PAF诱导的血小板聚集作用（s,n=7)组别给药剂量mg/kg给药次数（次/d）给药后聚集率（%）血小板聚集抑制率(%)1min5minMax 生理盐水组等容积329.855.3349.157.5456.7710.23浙江康恩贝a产品（高）41.06322.
14、64.72*35.16.23*38.255.79*32.62浙江康恩贝a产品（中）20.53323.73.84*38.86.31*40.806.75*28.13浙江康恩贝a产品（低）10.27325.055.6844.426.8745.717.38*19.48浙江康恩贝b产品（高）41.06322.64.43*29.85.14*31.955.25*43.72浙江康恩贝b产品（中）20.53323.24.53*34.05.36*34.675.67*38.93浙江康恩贝b产品（低）10.27325.845.3636.56.19*39.606.68*30.24浙江康恩贝c产品（高）41.06324.
15、384.4330.15.32*32.805.44*42.22浙江康恩贝c产品（中）20.53323.404.2537.66.48*35.717.38*37.10浙江康恩贝c产品（低）10.27324.034.5638.976.54*40.206.93*29.19江苏某药企（高）41.06322.874.8936.56.26*38.716.40*31.81江苏某药企（中）20.53323.14.24*37.56.68*39.236.35*30.90江苏某药企（低）10.27324.665.7938.816.46*40.936.66*27.90上海某药企A（高）53.36323.55.02*37.
16、26.67*37.706.39*33.59上海某药企A（中）26.68323.15.31*37.16.23*37.947.11*33.17上海某药企A（低）13.34322.65.30*39.406.75*39.796.90*29.91上海某药企B（高）41.06321.165.14*37.66.48*38.466.13*32.25上海某药企B（中）20.53322.245.47*38.976.54*39.576.52*30.30上海某药企B（低）10.27322.085.33*36.56.26*40.326.89*28.98与NS组比较，*p0.01,*p0.052.2.2家兔PAF含量检测
17、结果检测结果表明四个药厂的六种银杏叶提取物均能降低家兔血清中的PAF含量（p0.05）。（见表4）表四 PAF含量检测结果（s,n=7)组别PAF含量（ng/ml）给药前给药后生理盐水组 6.692.72 6.743.03浙江康恩贝a产品（高）6.442.144.201.65*浙江康恩贝a产品（中）6.652.334.361.41*浙江康恩贝a产品（低）6.592.274.881.83浙江康恩贝b产品（高）6.472.214.081.25*浙江康恩贝b产品（中）6.502.664.121.04*浙江康恩贝b产品（低）6.712.834.131.17*浙江康恩贝c产品（高）6.532.674.1
18、01.19*浙江康恩贝c产品（中）6.511.984.151.62*浙江康恩贝c产品（低）6.432.074.301.80江苏某药企（高）6.632.114.311.55*江苏某药企（中）6.532.284.241.59*江苏某药企（低）6.582.674.531.97上海某药企A（高）6.432.134.221.55*上海某药企A（中）6.502.094.301.64*上海某药企A（低）6.392.094.331.87上海某药企B（高）6.431.984.141.32*上海某药企B（中）6.492.004.201.72*上海某药企B（低）6.551.974.451.85给药前后比较，*p0.
19、01,*p0.053. 讨论血小板聚集有多种诱导机制，AA、ADP、PAF是通过三条不同的机制来诱导血小板聚集的，这三条途径也是血小板聚集的主要途径。虽然途径不一样，但最终都是通过降低血小板cAMP水平和增加Ca2+浓度而引起血小板活化的，随之血小板黏附，从而形成血栓。AA是中等强度的血小板聚集诱导剂，通过COX的作用转变为TXA2，发挥血小板聚集作用。ADP是通过打开血小板细胞膜上的钙离子通道促进外钙内流而引起血小板活化。PAF是迄今为止发现的最强的血小板聚集剂，广泛存在于各种组织，它主要由中性粒细胞、血小板、肥大细胞、内皮细胞、巨噬细胞等产生，具有广泛的生物活性。通过本实验发现，四个厂家的
20、六种银杏叶提取物产品对PAF诱导的血小板聚集的抑制作用强于AA、ADP，其中浙江康恩贝的a、b产品拮抗PAF受体更为显著，这可能与其有更高的银杏内酯含量有关。不仅如此，四个厂家的六种银杏叶提取物产品均能降低家兔血清中PAF的含量，这对于预防与控制血栓的形成与发展具有重要的意义。阿司匹林和氯吡格雷是临床上抗血小板聚集的常用药，分别阻断AA途径和ADP途径，但近年来临床上出现阿斯匹林和氯吡格雷抵抗现象，是非常棘手的问题，即使两种药物联用有时也会治疗失败。阿司匹林和氯吡格雷对PAF途径没有任何作用，因此多一条阻断PAF的途径无不加强了抗血小板聚集的效果。通过本实验发现银杏叶提取物有显著的拮抗PAF受
21、体的作用，是不依赖于AA、ADP的第三条途径，并能显著降低实验兔血清中PAF的含量，是阻断PAF途径的有效药物，与阿司匹林和波立维联用可能会具有更好的抗血小板聚集效果。另外，在银杏叶提取物的同类产品中，通过现代工艺提高了银杏内酯含量的产品，具有更强的抗PAF的作用，从而将具有更高的临床应用价值。参考文献1黄继汉，黄小晖，陈志扬等.药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算J.中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069-10722Braquet P，Touqui L，ShenTY,etal.Perspectives in platelet activating factor researchJ.Pharmacol Rev，1987，39（2）：973常亚丽，常冬梅，肖冬杰等.血小板活化因子拮抗剂对血小板活化的研究J.临床血液学杂志，2008，21（11）：606-6074Guo N J，Chang YL，Xiao DJ，et al.Activation of Platelet-neutrophil mediated by platelet-activating factorJ.J Exp Hematol，2005，13：447-4515夏国栋，夏时海，血小板活化因子受体的研究进展J.世界华人消化杂志，2005，13（3）：381-384
