1、 福建森宝食品集团股份有限公司 企业标 准 Q/JCWI 0222 2013 动物性食品中 莱克多巴胺 药物残留检测 酶联免疫吸附法 2013 - 08 - 01 发布 2013 - 08 - 01 实施 福建森宝食品集团股份有限公司 发布 Q/JCWI 0222 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写给出的规则起草 本标准由公司检测中心提出并审核 本标准起草单位：检测中心 本标准起草人： 张丽丽 本标准批准人： 黄金兰 本标准于 2013年 8月 1日首次 发布。 Q/JCWI 0222 2013 II 修改履历表 版本 章节 条款 修
2、改内容或记录号 修改人 （起草人） 批准人 修改日期 （发布日期） 实施日期 A/0 全新发布 张丽丽 黄金兰 2013.8.1 2013.8.1 Q/JCWI 0222 2013 1 动物性食品中 莱克多巴胺 药物残留检测 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物可食性组织中 沙丁胺醇 药物残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法 . 本标准适用于适用于定量检测动物尿液样品中的 莱克多巴胺 。 2 试验原理 样品中游离的莱克多巴胺与酶标记物竞争结合微孔中固相包被的莱克多巴胺特异性抗体，经过孵育后进行清洗，所有未与抗体结合的药物在清洗步骤中被清除，与抗 体结合的酶标记物由显色剂显示出来，因为
3、酶可以使无色的显色剂转变成蓝色，终止液的加入可以终止反应，蓝色转变成黄色，吸收值可以在450nm处进行测定，颜色变化的程度反映样品中莱克多巴胺的含量 。 3 交叉反应率 沙丁胺醇 100% 克伦特罗 35% 特布他林 22% 齐帕 特罗 9% 西玛 特罗 2% 班布特罗 小于 0.1% 莱克多巴胺 小于 0.1% 4 设备及试剂 以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合 GB/T 6682规定的二级水。 4.1 设备 微孔板酶标仪（有 450nm滤光片） 离心机 刻度移液管： 10ml 洗耳球 容量瓶 ： 500ml 玻璃试管 ： 10ml 玻璃 烧杯 ： 1000ml Q/JCWI
4、 0222 2013 2 玻璃 棒 离心管 微量移液器：单道 20 200l、 100 1000l 多道 250l 5 试剂盒提供的材料与试剂 包被有抗体 的微孔板： 1块 （ 12条 8孔，可拆分 ） 酶标物冻干粉： 1瓶 酶标物 溶解液： 1瓶（ 13ml） 清洗液 20： 1瓶（ 25ml） 显色剂： 1瓶（ 13ml） 终止液： 1瓶（ 13ml） 标准品 ： 8 1ml/瓶 （ 0ppb,0.15ppb,0.3ppb,0.6ppb,1.25ppb, 2.5ppb,5ppb,10ppb） 6 溶液的配制 配液 1: 酶标物工作液 使用时精确加入 12mL酶标物溶解液到酶标物冻干粉充分溶
5、解约 1小时，使用前摇匀，切勿涡旋振荡，回温后即可使用 。 配液 2: 清洗液 用蒸馏水按 1： 20（ 1+19）稀释 7 样本前处理步骤 7.1 处理任何样本时，都必须注意： a) 实验中必须使用一 次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 b）实验之前须检查各种实验器具是否 洁 净， 必须使用洁净 实验器具 ，以避免污染干扰实验结果。 c）终止液具有刺激性，显色剂具有毒性，切勿接触皮肤。 d）不要在有效期过后使用试剂。 e）不同批号的试剂不得混用。 7.2 样本前处理方法 尿液： 可以直接进行检测或者在样品比较混浊时， 5000rpm离心 5min或过滤，取 50L上清液检测 。 稀释倍
6、数： 1 8 检测步骤 8.1 测定前应须知： 测定前应须知： Q/JCWI 0222 2013 3 1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温 （ 20-25 /68-77 ） 。 回温 1小时以上，一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度 。 2、使用之后立即将所有试剂放回 2-8 （ 36-46） 。 3、在 ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA测定程序中的要点。 4、加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面。 8.2 操作步骤： 8.2.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温 （ 20-25 /68-77 ） 平衡 30mi
7、n 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 8.2.2 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔 板 放入自封袋，保存于 2-8（ 36-46） 。 8.2.3 尿样稀释液在使用前也需按 上述方法回温 。 8.2.4 编号： 将样本和标准品对应微孔按序编号 ， 每个样本和标准品做 2 孔平行 ， 并记录标准孔和样本孔所在的位置。 8.2.5 加标准品 /样本和酶结合物工作液：加标准品 /样本 50l 到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液 100l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 10min。 8.2.6 洗板： 小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入去清洗液 250l/孔，充
8、分洗涤 3 4 次，每次间隔 10s，泼掉板孔内液体，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用吸耳球吹破） 。 8.2.7 显色： 加入 显色剂 100l/孔 ，轻轻振荡混匀，用盖板膜 盖板后置 25避光环境反应 10min。 8.2.8 测定： 加入终止液 100l/孔，轻轻振荡混匀， 在 450nm 下检测吸光度，结果在 10min 内读取最佳， 30min 内有效 。 9 结果 计算 9.1 百分吸光率的计算 ,标准品或样本的百分吸光率等于 标准品或样本的 平均 吸光度值（双孔）除以第一个标准（ 0 标准）的 平均 吸光度值 ,再乘以 100%， 即 百分吸光 率 （ %） = B 100
9、% B0 B 标准 品 或样本溶液的平均吸光度值 B0 0ppb标准溶液的平均吸光度值 9.2 标准曲线的绘制与计算 将每个标准 的 B/ B0值输入半对数系统中，对应于各自的 莱克多巴胺 标准的浓度可以获得一个标准曲线。 以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度（ ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中 ,从标准曲线上读出样本所对应的浓度， 乘以其对应的稀释倍数即为样本中 莱克多巴胺 的实际浓度 ， 用 ppb（ g /kg或 g /L）表示。 10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 试剂盒灵敏度： 0.5 0.2ppb 样本最低检测限： Q/JCWI 022
10、2 2013 4 尿液 0.3ppb 回收率 ： 尿液 90 10% 11 注意事项 11.1 室温低于 20或试剂及样本没有回到室温（ 20-25）会导致所有标准的 OD 值偏低 。 11.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作 。 11.3 每加一种试剂前需要将其摇 匀。 11.4 反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。 11.5 不要使用过了有效日期的试剂盒 ；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺 杂使用 过了有效期的试剂盒 会引起灵敏度的降低 ； 不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 11.6 保存试剂盒于 2-8（ 36-46） ，不要冷冻，将不 用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 11.7 在 22-25条件下 Bo 吸光度应大于 0.8。 11.8 该试剂盒最佳反应温度为 25，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果 。 12 贮藏条件及保存期 贮藏条件：保存试剂盒于 2-8 (36-46 )环境中。 保存期：该产品有效期为 12个月。 _
