1、1洁净室和其它可控环境的评估这一章的目的是讨论各种主题，内容涉及大批量药品的无菌加工、剂量形式、案例、医用设备以及可控环境质量的建立、维护和控制。本章讨论的内容包括：（1）基于微粒数限度的洁净室分级；（2 ）可控环境的评估程序；（3 ）人员培训；（ 4）评估程序设计和执行的关键因素；（5）取样计划的改进；（6 ）警戒限和行动限的建立；（ 7）取样的方法和仪器；（8）培养基和稀释剂；（9 ）微生物分离物的鉴定；（ 10）经由培养基灌装的操作评估；（11）术语。排除在本章以外的是一个关于注册药品可控环境的讨论，适用于国内灭菌产品的制备。这部分内容包括在药物研制无菌制备。无菌工艺可控环境状态的评估和
2、控制有多种方法可供选择。包含在本章内的数值并不代表绝对值和规定，只是指导性的。给出几种取样设备和方法，其中之一不能适度的表明保证微生物控制所需水平的数值的达到或者偏移本章所示数值之外，即为失控。取样和分析的不适当应用可能导致重大的可变性和易忽视污染的潜在。出现在本章中的取样用培养基，装置以及方法并不是规定性的，只是作为指导。一大部分无菌产品通过无菌工艺生产。由于无菌工艺依赖于工艺流程中微生物的排除和灌装期间微生物进入敞开容器的防止，因此产品的生物负荷和生产环境的微生物负荷一样，是和这些产品的无菌保证水平相关的重要因素。洁净室级别的建立洁净室的设计和结构以及环境控制包含在联邦标准 209E。空气
3、洁净程度根据空气中绝对微粒浓度来定义。用于划分可控环境洁净级别和空气微粒监测的方法也包含在其中。本联邦文件只适用于可控环境的空气微粒，并不打算描述活性和非活性微粒的本质。联邦标准 209E 关于制药工业中洁净室和其它可控环境的应用已被制洁净室造商采纳，用来提供厂房、试车和设施维护规范。然而制药工业中可用的数据并不能提供一个非活性微粒数和可存活微生物浓度之间的关系的科学结论。电子工业中非活性微粒数的危险程度使得联邦标准 209E 的应用非常必要。但2是制药工业中更多的涉及到活性微粒（如：微生物），而不是联邦标准中详细说明的总微粒数。制药工业中存在一个关于注射药品总微粒计算的明确关注。（见注射剂中
4、的颗粒物）。洁净室中出现的微粒越少微生物存在的可能性越小，这一基本原理已被接受，并可为药品生产商和洁净室以及其它可控环境的建筑者在建立一个适当的设施时提供技术标准。联邦标准 209E 在制药工业中的应用是基于0.5m 的所有微粒的限度。表 1 描述了联邦标准 209E 中适用于制药工业的空气微粒的洁净级别。制药工业涉及 M3.5 和以上的级别，级别 M1 和 M3 与电子工业相关，列在表 1 中作为比较。如果气流、温度和湿度不变，洁净室或其它可控环境中出现的微粒数越少操作条件下的微生物数越少已被广泛接受。洁净室被维持在一个在动态（操作）数据基础上操作控制的状态。表 1.空气微粒洁净级别Clas
5、s Name级别名称Particles equal to and larger than 0.5 m 0.5m 的微粒SI国际单位制U.S.Customary美国惯例(m3 )立方米(ft3 )立方英尺M1 10.0 0.283M1.5 1 35.3 1.00M2 100 2.8M2.5 10 353 10.0M3 1,000 28.3M3.5 100 3,530 100M4 10,000 283M4.5 1,000 35,300 1,000M5 100,000 2,830M5.5 10,000 353,000 10,000M6 1,000,000 28,300M6.5 100,000 3,5
6、30,000 100,000M7 10,000,000 283,000 根据联邦标准 209E洁净室和洁净区空气微粒洁净级别（1992-11-11）改写。3可控环境评估程序的重要性监测可控环境中的总微粒数，即使用一个可连续监测的电子装置，也不能提供全面的环境信息。粒子计数器的局限性在于它只能测量0.5m 的微粒，而空气中的微生物并不是自由漂浮的或单个的细胞，它们经常附着在 10-20m 的微粒上。可控环境内的微粒数和微生物数一样，随着取样地点和取样时的操作变化。监测环境中的非活性微粒和微生物是一个很重要的控制手段，因为它们对于注射剂微粒和无菌能否达到要求有很重要的作用。可控环境的微生物监测也应
7、当评估清洁与卫生操作的效果，这些由人员进行的操作可能对可控环境的生物负荷有影响。无论系统多么完善，微生物监测也不需要确定和测定出现在可控环境中的所有微生物污染。但是，常规的微生物监测应当提供有效信息，确定可控环境在一个适当的控制状态下运行。由合格人员进行的环境微生物监测和数据分析，可以允许洁净室和其它可控环境控制状态的维持。环境取样应在正常操作下进行以得到有意义数据。微生物取样应该在物料已到达指定区域，加工活动正在进行，所有操作辅助人员都在位时进行。适当的时候，洁净室和其它可控环境的微生物监测应该包括洁净室空气和压缩空气的微生物含量的确认，压缩空气会进入关键区域、表面、设备、洁净容器、地板、墙
8、壁和人员衣物（如：衣服和手套）。微生物监测的目的是获得环境生物负荷有代表性的评估。当数据被编辑和分析后，应由受训人员进行趋势分析。同时按照推荐和指定的频率回顾环境监测结果是很重要的。回顾长期的结果以确定趋势是否存在也是很关键的。通过包括警戒限和行动限的统计控制图表的构建，趋势可被形象化。依据这些趋势数据，可以对可控环境的微生物控制进行不完全的评估。周期性的报告或总结应该提交以提醒责任经理。当可控环境指定的微生物水平超出时，应当有文件对此进行回顾和调查。调查的详细内容可能有所不同，主要依赖于在洁净室内生产的产品的类型和工序。调查应该包括以下内容的回顾：区域维持文件；卫生处理文件；固有的物理或操作
9、参数（如：环境温湿度的变化）；有关人员的培训状态。调查之后，4所采取的行动可能包括：加强人员培训，强调环境的微生物控制；增加取样频率；增加卫生处理；增加产品检测；鉴定微生物污染和其可能来源；如果必要，对现行的标准操作规程重新评估并验证它们。根据调查回顾和测试结果，可确定被超出微生物水平的重要性和在那种条件下操作或加工产品的可接受性。任何调查和行动方针基本原理应当有文件证明并作为质量管理系统的一部分。可控环境如洁净区或洁净室被，通过证明其符合相关洁净室运行标准被定义。评估参数包括滤器完整性、风速、气流模式、换气次数和压差。这些参数可影响洁净室运行的生物负荷。由于洁净室的设计、结构和运行变化很大，
10、使得归纳这些参数要求变得困难。一个关于指导系统微粒挑战试验的方法和设备已被 Ljungquist and Reinmuller 改进，这种方法主要是在关键工作区域的邻近增加周围环境的微粒浓度。首先，烟尘的产生使得空气运动在整个洁净室或可控环境中被形象化，漩涡或者紊流区域的存在可被显现出来，气流模型可被有规则的调整以消除或降低不受欢迎的影响。然后，在关键区域和无菌区域附近产生颗粒物质。这种评估在模拟生产状态下进行，但设备和人员必须在场。在微生物监测程序验证完成前，洁净室或可控环境物理特征的正确测试与优化是非常重要的。确保可控环境按照要求的技术标准运行，将给出一个更高的保证，即环境的生物负荷适合无
11、菌加工生产。这些检测应该在洁净室或可控环境常规确认期间重复进行，洁净室运行的任何变化，如：人员流动、加工生产、操作、物料流动、空气处理系统或者设备布局，被认为是重大的。人员培训为了达到环境质量水平适合最终产品的无菌保证，无菌加工产品需要生产商更注意细节，并对人员实行严格的纪律和监督。在可控环境中工作的所有人员的培训是关键的。这种培训和人员对微生物监测程序所负的责任是同等重要的。在微生物取样期间，洁净工作区可不经意的发生污染。在高度自动化运行条件下，监测人员可能是和加工生产区内关键地带直接接触的职工。在加工生产区域内工作前后，人员的监测应该被执行。由于不正确的取样技术，取样可能带来潜在的微生物污
12、染。这种形式的培训应当进5行以减少风险。对所有进入可控环境的人员，这种形式的培训应当有文件证明。设施的管理必须保证所有在洁净室或可控环境中操作的人员精通相关原理。这个培训应当包括无菌工艺基本原理的教育，生产和操作程序与产品污染潜在来源的关系。培训还应当包括对涉及无菌工艺的人员进行微生物学、微生物生理、消毒与卫生、培养基的选择和制备、分类和灭菌等基本原理的教育。对从事微生物鉴定的人员需要进行满足实验室方法的专门的培训。必须对有关人员提供关于收集到的环境资料管理的额外培训。对可适用的标准操作规程的认识和理解是很关键的，尤其是那些对环境发生变化时采取调整措施的标准操作程序。与执行调查和分析数据培训一
13、样，GMPs 中关于调整规则和个体责任的理解也应当是培训程序的主要部分。可控环境中微生物污染的主要来源是人员，污染可随着通过人员的微生物的散布而发生，尤其是有传染病的人员。只有健康的人员才能被允许进入可控环境。这些因素强调良好的个人卫生和注意无菌着衣程序（进入可控环境的人员使用）的细节的重要性。一旦这些操作人员适当的着衣（包括全部的面部覆盖），他们必须一直仔细的维持他们的手套和衣服的完整。通过无菌加工的产品污染的主要威胁来自人员，因此，与人员有关的微生物污染的控制是环境控制程序中最重要的部分。在可控环境中工作的人员的彻底培训的重要性，包括无菌技术，不能被过分强调。环境监测程序自身不能察觉所有在
14、无菌加工生产过程中危及环境质量的事件。因此，周期性的进行培养基灌装或过程模拟分析使工艺重新有效，对于保证适当的运行控制和培训被有效的保持是十分必要的。环境控制程序设计和执行的关键因素一个环境控制程序应当能够及时的察觉环境条件的不利漂移，从而允许进行有意义的和有效的纠偏行动。开展、启动、执行和证明这样一个环境监测程序是生产商的责任。6虽然关于环境控制程序的常规建议将被讨论，但是被裁剪的有关明确的设施和条件的程序是强制性的。常规的培养基如大豆酪蛋白消化液培养基，在大多数情况下是适用的。如果在消毒剂或抗生素存在的环境下使用或加工，这种培养基可能被添加附加物以克服或减少消毒剂或抗生素的影响。酵母菌和霉
15、菌的监测和确认也应当被考虑。常用的真菌培养基，如沙氏培养基、改良沙氏培养基或霉菌抑制培养基都是可接受的。其它被验证的真菌促生长培养基，如大豆酪蛋白消化液培养基也可被使用。通常，必须的厌氧性生物的检测没有被常规进行，但是应该有正当的条件或调查理由支持，如：在无菌测试设施中的有机体的鉴定，显示更频繁的测试。选择培养基用以监测和确认厌氧和好氧微生物的能力应当被评估。一旦选好适当的培养基，培养的时间和温度的应当被确定。典型的培养温度是 22.5 2.5 和 32.5 2.5，培养时间分别是 72 和48 小时。用于环境监测程序的培养基的制备，其灭菌程序应当被验证。除此之外，培养基还应按照无菌测试 进行
16、无菌和促生长测试。另外，对于促生长测试，从可控环境中分离到的或来自 ATCC 的代表性菌株也应当被用于测试培养基。当浓度低于 100cfu 的挑战微生物被接种到培养基上时，培养基必须能够支持它们的生长。对于环境取样，一个是适当的环境控制程序应当包括取样位点的鉴定和评估，以及方法的验证。用于分离物鉴定的方法应当用指示微生物验证（见微生物限度检测）。取样计划和位点的建立在洁净室或其它可控环境起始启动或试车期间，对空气和表面取样的精确位点应当被确定。考虑的因素包括与产品接近程度，是否空气和表面可能与产品或封闭容器的敏感表面接触。还应考虑的是关键区域比非产品接触区域需要更多的监测。在非肠道药物的灌装操
17、作中，典型的操作区域应该包括密闭容器的供应、敞口容器的路径和操作人员常规处理的物体（如：污染物）。7取样的频率取决于指定位点的关键程度，以及被无菌加工后的产品接受的后续处理。表 2 显示的是建议的取样频率，随着取样频率的减少，对应关键程度的可控环境区域被依次取样。表 2. 基于可控环境级别推荐的取样频率Sampling Area取样区域Frequency of Sampling取样频率Class 100 or better room designations百级或更高级别的指定室Each operating shift每班次Supporting areas immediately adjace
18、ntto Class 100 (e.g., Class 10,000)与百级直接相邻的辅助区域（如：万级区域）Each operating shift每班次Other support areas (Class 100,000)其它辅助区域（十万级）Twice/week每周两次Potential product/container contact areas潜在的产品或容器接触区域Twice/week每周两次Other support areas to asepticprocessing areas but non-product con-tact (Class 100,000 or lower
19、)其它非产品接触的无菌加工区域（十万级或更低）Once/week每周一次随着运行期间手工干涉的增加以及人员和产品接触潜在的增加，环境监测程序的相对重要性也增加。与最终灭菌产品比较，环境监测对于无菌加工产品更为关键。微生物抵抗后续灭菌处理的测试和确认比周围生产环境的环境监测更为重要。如果最终灭菌循环不是基于过渡杀伤循环概念，而是生物负荷居先于灭菌，生物负荷程序值是危险的。取样计划应当是动态的，随着监测频率变化。取样计划位置的调整基于趋势的倾向。可根据这种性能适当的增加或减少取样。可控环境中警戒限和行动限的建立统计学过程控制的原理和概念，对于建立警戒限和行动限以及对趋势的反应是很有用的。环境监测中
20、的警戒限用来指示微生物水平是否有偏离正常水平的可能性。超过警戒限并不一定要采取纠偏措施，但应调查并修订取样计划。8环境监测中的行动限是指微生物水平超过要求的限度，须立即采取必要的纠偏措施。警戒限通常依赖于从明确的可控环境的工艺常规操作中获得历史信息。在一个新建的设施中，这些限度通常依赖于来自相似设施或工艺的先前经验；并且至少有几周的微生物环境限度数据应该被评估以建立一个基线。为了适应需求，这些限度通常以一个制定的频率被重新检查。当历史数据显示条件被改良，这些限度可被重新检查并变化以反映条件。显示环境质量变化的趋势要求分析可归属的原因，并实施纠偏措施是环境恢复到期望的范围。无论如何，应进行调查，
21、在产品上出现的潜在影响的评估也应当被进行。微生物考虑因素和可控环境的行动限根据联邦标准 209E，洁净室和其它可控环境的分级是基于这些环境中的总微粒数。制药和医疗设备行业通常采用百级、万级和十万级洁净级别，尤其是根据设施的结构规范。尽管 209E 可控环境的级别和限度之间没有建立直接的关系，制药行业已经用微生物限度来反映这些级别许多年；这些限度已被用来评估是否符合现行 GMP。用现有的技术可以很容易的满足这些限度已控制环境。已经有关于用不同的取样系统、培养基和培养温度获得这些限度的报导和关注。应该认识到，虽然没有任何系统是绝对的，但它能帮助我们察觉环境质量的变化以及趋势。在表 3、4 、 5
22、中显示的数值代表个人的测试结果，建议只是作为指导。每个制造商的数据必须被评估并作为整体监测程序的一部分。表 3. 可控环境中以 cfu 表示的空气洁净指导方针Class*级别cfu per cubic meter of air*cfu/每立方米空气cfu per cubic feet of aircfu/每立方英尺空气SI国际单位制U.S. Customary美国惯例M3.5 100 Less than 33Less than 0.10.1M5.5 10,000 Less than 2020Less than 0.50.59Class*级别cfu per cubic meter of air*
23、cfu/每立方米空气cfu per cubic feet of aircfu/每立方英尺空气SI国际单位制U.S. Customary美国惯例M6.5 100,000 Less than 100100Less than 2.52.5详细说明见联邦标准 209E(1992.9) 应当有足够体积的空气被取样以监测上述指定限度的偏移。 表 4. 可控环境中以 cfu 表示的设备和厂房洁净指导方针Class 级别cfu per Contact Plate* cfu/每接触皿SI国际单位制U.S. Customary美国惯例M3.5 100 3 (including floor)（包括地板）M5.5 1
24、0,000 510 (floor)（地板）接触皿的面积一般为 24 到 30 cm2。当用擦拭法取样时，取样面积应大于等于 24 cm2，但不应大于 30cm2。表 5. 可控环境中以 cfu 表示的操作人员洁净指导方针Class 级别cfu per Contact Plate* cfu/每接触皿SI国际单位制U.S. Customary美国惯例 GlovesPersonnel Clothing& Garb人员衣服M3.5 100 3 5M5.5 10,000 10 20见表 4 空气微生物确认的方法和仪器可控环境中空气中的微生物可影响在这些环境中生产的中间或最终产品的质量，这一观点已被科学家
25、广泛接受。空气中微生物的估测，可被用来完成这10些化验的仪器和程序所影响，这一观点也被广泛接受。因此，用不同的方法或仪器获得的结果的等值应该被确定。在未来，技术上的前进被期望带来创新，以提供比现行可用方法更精密和灵敏的方法，可能给出被检测到的微生物在绝对数量上的变化。现今，在美国制药和医疗设备行业中普遍应用的采样器是压紧式和离心式采样器。许多经济实用的采样器作为信息被列出，选择适当并可满足要求的微粒取样器是使用者的责任。狭缝式空气取样器 （STA）对于这个取样器，各种可控环境所依据的微生物指导方针在表 3 种被给出。设备被一个附带的可操纵真空泵控制，空气通过一个标准的裂缝进入，裂缝的下面被放置
26、了一个可缓慢旋转的含有营养琼脂的皮氏培养皿。空气中的微粒有足够的数量撞击到琼脂表面，可存活的微生物被允许在上面生长出来。细微的空气进入被用来减少层流区域的干扰。筛网撞击式取样器 这个仪器含有一个可容纳装有营养琼脂的皮氏培养皿的容器，容器的盖子有预定尺寸的穿孔。真空泵吸入已知体积的空气进入通过盖子，空气中含有微生物的微粒撞击到皮氏培养皿的培养基上。有些取样器有可利用的喷流系列，容器含有尺寸逐减的穿孔。这些设备可用于含有可存活微生物的微粒尺寸范围的分布的检测，原理是基于依照大小排列的穿孔允许微粒进入到琼脂平板上。离心式取样器 这个设备含有一个螺旋或涡轮，可将一定体积的空气引入设备，然后将空气推向并撞击到一个任意放置的营养琼脂条上，营养琼脂条被固定在一个柔软的塑料基座上。无菌心房 这个设备是一个单一分段的变量筛网式取样器。设备的盖子还有均一间隔的孔，尺寸大约为 0.25 英寸。设备的底部有一个装有营养琼脂的皮氏培养皿。一个真空泵通过设备控制气体的流动，有一个多单元的控制中心，即有可利用的远程取样探针。表面空气系统取样器 这个完整的设备有一个带卷送进区，可容纳一个琼脂接触平板，紧接着平板的后面是一个发动机和涡轮，可将空气通过设备盖子上的空推到琼脂接触板上，多重安装好的装配也是可用的。
