1、第四章 微生物细胞破碎,陈旭升,,生物工程学院B521,微生物制造与生态工学研究中心 发酵与生态工学研究室,微生物的外围通常包括细胞壁和细胞膜：,细胞壁：为细胞外壁，具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏的功能。,细胞膜：为细胞内壁，是一层具有高度选择性的半透膜，控制细胞内外一些物质的交换渗透作用。,细胞破碎的主要阻力来自细胞壁，不同类型的微生物、处于不同生长时期的同一种微生物，细胞壁的结构特性是不同的。,一、细胞壁的结构和化学组成1.细菌的细胞壁,2.酵母的细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、蛋白质（6-8%）和脂类，比G+更难破
2、碎。,酵母细胞壁结构示意图 M甘露聚糖；P磷酸二酯碱；G葡聚糖,酵母细胞,3. 霉菌的细胞壁,霉菌细胞壁主要由多糖（80-90%）组成，其次含较少的蛋白质和脂类，它的结构和纤维素很相似。,由于霉菌细胞壁中含几丁质或纤维素的结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,二、细胞破碎方法,1、机械方法 为了粉碎微生物细胞，常常选择机械的方法，因为它们的处理量大，破碎速度较快。采用这些方法，细胞受到由高压产生的高剪切力，但在大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏。,1、珠磨法,玻璃(2.5g/mL)氧化锆(6.0g/mL)粒径(0.11.0mm)填充率(
3、8085%),ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,珠磨法是利用玻璃珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞获得破碎。,搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅拌。,珠磨机搅拌盘设计图 珠磨机搅拌盘与驱动轴方位示意图,S 破碎率；t为破碎操作时间或平均停留时间; k破碎速度常数，与搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠直径以及温度等操作因素相关,微珠直径:目标细胞直径 30100细菌浓度 60120g/L酵母浓度 140180g/L,优点：容易操作，破碎率可控制，易放大；实
4、验室和工业规模均可用；绝大多数微生物细胞均适用。,缺点：产生大量热能，能量利用率仅1%；影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化较复杂。,2、高压匀浆法,高压匀浆法是利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。,高压匀浆器针型阀结构简图,高压匀浆器各种阀型设计,压力：5070MPa速度：450m/s,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方程可表示为：,式中 R细胞破碎率 K与温度等有关的破碎常数 N悬浮液通过匀浆器的次数 P操作压力 a与微生物种类
5、有关的常数。,高压匀浆法适合于酵母和细菌的大规模破碎；不适于丝状菌破碎。,NOTICE:,3、Xpress法 将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。此法称为Xpress法，主要用于实验室中。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。该法对冷冰融解敏感的生化物质不适用。,4、超声波破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎
6、。 破碎原理：在高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的展波。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。,频率超过15-20KHz,优点：适合于多种细胞的破碎；处理少量样品操作方便；液体损失少；破碎率高。缺点：有效能量利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）；不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎；影响因素多：细胞种类、浓度、超声波的声频等。,（1） 酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的
7、目的。,2、非机械法,常用的溶酶,溶菌酶；-1，3-葡聚糖酶；-1，6-葡聚糖酶；蛋白酶；甘露糖酶；糖苷酶；肽键内切酶；壳多糖酶等。,溶菌酶能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,Example,优点：选择性释放产物;条件温和;核酸泄出量少;细胞外形完整。缺
8、点：溶酶价格高;溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶）;产物抑制的存在。,自溶作用是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。 影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。 自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,（2）渗透压冲击 是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处
9、理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,（3） 反复冻结融化 可用于某些细胞的破碎，或释放某些细胞组分。冻结融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,（4）干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 空
10、气干燥主要适用于酵母菌，一般在2530的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。 真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冰条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。,（5）化学渗透法:某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层
11、，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。,表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,EDTA螯合剂,酸碱破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,有机溶剂,变性剂,盐酸胍
12、（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,值得一提的是，除了应研究破碎细胞的方法外，还应研究在生物合成过程中减低细胞牢固程度的方法。,三、目标产物的选择性释放,目标产物在细胞内的位置：细胞质内细胞器
13、内细胞膜或细胞壁附近（如革兰氏阴性菌周质空间中的蛋白）细胞膜或细胞壁处于结合状态选择性释放：使细胞不完全破碎，选择性释放目标产物，尽量减少其他物质的释放。,选择性释放原则：仅破坏或破碎存在目标产物的位置 细胞膜附近：温和的方法(酶法)，或采用较温和的机械破碎条件，降低细胞破碎程度。 细胞内：机械破碎选择性溶解目标产物 目标产物与细胞膜或细胞壁处于结合状态 调整溶液pH、离子强度、添加能够溶解释放目标产物的试剂(如表面活性剂、螯合剂)。,化学渗透法选择性释放胞内产物流程图,四、破碎率的测定,a. 直接测定 利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完整细胞区分开。 如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳
14、性菌染成阴性菌的颜色； 受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫色。b. 测定释放的蛋白量或酶活 将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度或酶活。c. 测电导率 电导率随破碎率的增加而线性增加,1、多种破碎方法相结合 化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。,五、细胞破碎的发展趋势,2、与上游过程相结合 （1）克隆噬菌体裂解基因, 噬菌体裂解基因,举例： 于慧敏等构建得到了一株具有噬菌体裂解基因的产PHB重组大肠杆菌，通过发酵后期升高温度至50保温2h
15、，或者加入螯合剂EDTA，均可使细胞裂解释放出目标产物PHB。,图 不同时刻和裂解处理前后的PHB颗粒,PHB：聚-羟基丁酸酯，是一种生物可降解塑料,（2）耐高温产品的基因表达 在破碎和分离过程中，为防止产品失活而消耗的制冷费是相当可观的。如果产品能表达成耐高温型，那么在较高的温度下进行操作既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。,嗜热酶,嗜热微生物,3、避开菌体破碎的方法 需要进行细胞破碎的前提是目标产物存在于细胞内，当目标产物可以在发酵过程中释放到胞外，则细胞破碎的操作即可省去。 毕赤酵母、枯草芽孢杆菌,跨膜运输，分泌到胞外,蛋白质,信号肽序列,Summary,细胞破碎常用方法：珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press法、酶法、化学法、渗透压法、冻融法、干燥法；细胞破碎率的测定方法；细胞破碎与上下游联系。,
