1、第二十二章 免疫学检测,(Immunological detection technology),.,Deptertment of medical Microbiology and Immunology韩莉教授,医学免疫学,免疫学检测技术 通过免疫学相关技术，对免疫细胞、免疫分子及其相关基因等进行定性或定量检测。 可应用评价机体免疫功能状况、研究相关疾病的发病机制、诊断、治疗效果、监测病情发展与转归、科学研究等领域。,主要内容,体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素检测抗原抗体的体外实验免疫细胞及其功能的检测免疫学检测的临床应用,第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素,抗原抗体检测的原理抗
2、原抗体基本特点抗原抗体反应的影响因素,一、抗原、抗体检测原理,抗原与相应抗体发生特异性结合，并在外界条件影响下出现肉眼可见或借助仪器可检测的各种现象，如凝集或沉淀。借此可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体），因所采用的抗体常存在于血清中，故称为血清学反应。,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,二、 抗原抗体反应的特点,1. 特异性,2.适宜的抗原抗体浓度和比例,postzone,prozone,前带现象,后带现象,二、 抗原抗体反应的特点,3.表面化学基团之间可逆性结合 亲和力与环境因素,4.抗原抗体反应的两个阶段,抗原抗体结合过程可分为两个阶段：一是特异性结合阶段，二是可见
3、反应阶段。,三、 抗原抗体反应的影响因素,抗原和抗体的浓度、比例及性质电解质温度酸碱度反应时间,第二节 检测抗原抗体的体外实验,凝集反应沉淀反应补体参与抗原抗体反应免疫标记技术蛋白质芯片技术,1. 凝集反应,直接凝集间接凝集协同凝集试验微粒捕获酶免疫分析技术,（1）直接凝集,红细胞,抗红细胞抗体（IgG）,+,凝集,用于：ABO血型测定 细菌鉴定（肥达试验）,（2）间接凝集,激素抗体,激素包被的乳胶颗粒,+,凝集,常用载体：绵羊红细胞、聚苯乙烯乳胶等。可用于：细菌、病毒、寄生虫感染、自身免疫病的辅助诊断。,2. 沉淀反应,可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象，称为沉
4、淀反应。,该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇形成可见的白色沉淀现象。,速率散射比浊法免疫比浊法,（1）单向免疫扩散,Ab,待测血清（Ag）,不同浓度的标准血清,d,c,d,火箭电泳,（2）双向免疫扩散,Ag,Ab,将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，抗原抗体会自由地向四周扩散，在它们相遇的位置形成一条沉淀线，是一种定性检测法。,Ag1,Ag1,Ab1,Ag1,Ag2,Ab1、2,Ag1,Ab1、2,3.免疫标记技术,免疫标记技术是用荧光素、酶、放射性核素、胶体金或化学发光物质等标记抗体或抗原，利用标记技术的高度敏感性进行抗
5、原抗体检测。,可见,优点:灵敏度高、快速、可定性、定量、定位。,分类：根据标记物的不同，免疫标记技术可分为免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫技术、胶体金和化学发光技术。,胶体金,免疫标记技术种类,免疫荧光技术免疫荧光显微技术a.直接荧光法b.间接荧光法流式细胞术其它 酶免疫测定联免疫吸附试验酶免疫组织化学技术放射免疫分析法液相法固相法免疫胶体金技术发光免疫分析技术免疫印迹法该法,（1）免疫荧光技术,常用荧光素： 异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）等,直接法,间接法,冲洗,冲洗1,冲洗2,可通过荧光显微镜或流式细胞仪观察荧光。,（2）酶免疫测定,将抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的高效
6、性相结合,通过酶作用于底物后的显色反应判定结果.,常用标记酶:辣根过氧化物酶(HRP),邻苯二胺,HRP,催化,显黄色,E,Ag,OPD,Ab,HRP,酶联免疫吸附试验(ELISA),双抗体夹心法,间接法,将抗原抗体反应在固相上进行,通过洗涤除去游离成分.目前是应用最广的免疫酶技术。,待测为抗原,待测为抗体,冲洗,（3）放射免疫技术(RIA),定义：用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫检测的方法。,常用标记物：125I和131I,特点：灵敏度高（pg），故用于测量微量物质，如激素、吗啡、地高辛、IgE等。,不足：射线污染,（4）免疫胶体金技术（ICS）用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或
7、抗体的方法称免疫胶体金技术。用途：免疫电镜 免疫层析法,（5）发光免疫分析技术（ CLIA）,以发光现象作为抗原-抗体反应的指示系统，通过自动发光分析仪测定光子产量，可定量检测抗原或抗体。包括发光酶免疫分析、生物免疫分析、化学发光免疫分析和电化学发光 。常用标记的化学发光物质有吖啶酯、鲁米诺等具有灵敏度高、特异性强、自动化分析、试剂价格低廉，方法稳定、快速等优点。用于各种抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等超微量活性物质的检测分析技术。,(6)免疫印迹法（immunoblotting）,经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上将待检病人血清加入覆盖
8、于硝酸纤维膜上加入标记的第二抗体使之覆盖膜上加入显色底物（或放射自显影）显现第二抗体,5.蛋白质芯片技术,免疫学测定方法敏感性比较,第三节 免疫细胞及其亚群的检测,一、免疫细胞的分离外周血单个核细胞的分离淋巴细胞及其亚群的分离单核-吞噬细胞分离二、免疫细胞功能的测定T淋巴细胞功能测定B淋巴细胞功能测定NK细胞功能测定单核-吞噬细胞功能测定,一、免疫细胞分离,（一）外周血单个核细胞的分离,免疫细胞数量与功能的是判断机体免疫功能状态的重要指标.,单核细胞吸附,未吸附的为淋巴细胞.,玻璃培养皿,1.092,1.075,淋巴细胞分离液：1.077,（二）淋巴细胞及其亚群的分离,免疫吸附分离法 磁珠分离
9、法(immune magnetic bead，IMB) 流式细胞术(flow cytometry，FCM)尼龙毛分离法 E花环沉降法 抗原肽-MHC分子四聚体技术,1.免疫吸附分离法,2. 磁珠分离法,特点:简便, 快速, 费用低, 无需特殊设备,3. 利用FCM技术进行细胞分选,4. 抗原肽-MHC分子四聚体技术,（三）单核-吞噬细胞分离,体外：Percoll连续密度梯度离心法平皿黏附法分离(阳性分选)体内：斑蝥敷贴法等,（四）免疫细胞的计数,1. T细胞检测直接计数间接免疫荧光法免疫组织化学法、葡萄球菌花环法微量细胞毒试验2. B细胞检测膜表面免疫球蛋白（mIg）检测 间接免疫荧光法细胞亚
10、群检测,二、免疫细胞功能测定,T淋巴细胞功能测定B淋巴细胞功能测定NK细胞功能测定吞噬细胞功能测定,（一）T细胞功能测定,T淋巴细胞增殖试验 T细胞介导的细胞毒试验 T细胞分泌功能测定流式细胞术对T细胞功能的检测 T细胞功能的体内试验 ：包括接触性超敏反应、移植物抗宿主反应(GVHR)、迟发型超敏反应(DTH) 等,1. T淋巴细胞增殖试验,形态学方法 放射性核素掺入法MTT法 抗TCRV等位基因片段产物检测法,PHA,形态学测转化率,ConA,增殖,淋巴细胞增殖实验：放射性核素掺入法,T细胞介导的细胞毒试验,酶联免疫斑点试验(enzyme-Linked immonospot assay，EL
11、ISPOT),流式细胞术对T细胞功能的检测,T细胞功能的体内试验,迟发型超敏反应(DTH)：结核菌素反应,（二） B淋巴细胞功能测定,B细胞增殖(转化)试验溶血空斑形成试验酶联免疫斑点法(ELISPOT),溶血空斑实验,酶联免疫斑点试验(enzyme-Linked immonospot assay，ELISPOT),（三） NK细胞功能试验,放射性核素51Cr、125I-UdR释放法乳酸脱氢酶释放法 形态学检测化学发光法,巨噬细胞吞噬功能测定 巨噬细胞胞毒作用测定 中性粒细胞趋化功能测定 中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定 中性粒细胞噬菌试验 硝基蓝四氮唑 化学发光试验,（四）吞噬细胞功能试验,第四
12、节 免疫学检测的临床应用,认识、阐明相关疾病发病机制诊断、辅助诊断相关疾病免疫功能检测与监视科学研究,一、认识、阐明相关疾病发病机制,白细胞中性粒细胞趋化作用 障碍,二、诊断、辅助诊断相关疾病,（一）用已知抗体检测未知抗原检测病原体及其抗原组分 肿瘤抗原的定性、分型、定量与定位 HLA分型、红细胞血型抗原（二）用已知抗原检测未知抗体病原特异性抗体 变应原抗体 自身抗体 细胞毒抗体,三、免疫功能检测与监视,体液免疫功能：免疫球蛋白、B细胞数量与功能. 细胞免疫功能：T细胞总数与亚群 、T细胞功能 非特异性增殖反应：对特异性抗原的T细胞增殖反应细胞介导的细胞毒试验测定T细胞产生的细胞因子细胞因子（
13、及其受体）和黏附分子水平非特异性免疫功能,临床病案讨论：,李XX，男，21岁，在校大学生，同性恋，2015年7月就诊为艾滋病可疑？主诉：发热伴口腔疼痛20天现病史：持续发热39.5、鹅口疮、腹泻、体重减轻10公斤、反复呼吸道感染。辅助检查：HIV 抗体阳性、粪便培养霉菌阳性。请问：此病人要明确诊断还应做什么检测？,第二十三章 免疫学防治,(Immunological detection technology),.,Deptertment of medical Microbiology and Immunology韩莉教授,医学免疫学,患脊髓灰质炎的儿童 （Child with polio se
14、quelae WHO）,WHO 宣称2003年在全球已消灭脊髓灰质炎,Boy with smallpox,一、免疫学预防 通过人工刺激机体产生、或直接输入免疫活性物质，从而特异性清除致病因子，达到预防疾病的目的。,免疫学防治: 根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学手段人为增强或抑制免疫功能，以达到对某些疾病进行预防和治疗的目的。,二、免疫学治疗 达到治疗疾病目的的措施。,一、免疫学预防, 概念：人工免疫是用人工方法将抗原或抗体制成制剂（生物制品），接种于人体，使其获得特异性免疫功能，以达到防治某些疾病的目的。,人工主动免疫与被动免疫的比较,（一）人工主动免疫,用人工的方法给机体接种疫苗、类毒
15、素等抗原性物质，使机体免疫系统发生的特异性免疫应答过程，从而获得特异性免疫力。,1、传统疫苗：用于抗微生物感染的疫苗,减毒活疫苗：如卡介苗、麻疹活疫苗、脊髓灰质炎疫苗，优点：免疫原性强灭活疫苗：如流感疫苗、甲肝疫苗，优点：安全类毒素疫苗 ：如白喉，破伤风和霍乱等。 亚单位疫苗与多肽疫苗：如：乙肝疫苗、HPV（宫颈癌）疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等载体疫苗：核酸疫苗可食用疫苗,牛分支杆菌 Mycobacterium bovis,置于含胆汁的培养基，逐渐增加胆汁的浓度,13年,卡介苗 Bacillus Calmette-Guerin (BCG),在胆汁中适应性生长，充分减毒成为预防肺结核的疫苗。,流感疫
16、苗制备流程,灭活疫苗与减毒疫苗的比较,类毒素疫苗,类毒素是用细菌的外毒素经0.30.4%甲醛处理制成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗,亚单位疫苗,提取或合成天然微生物某些成分的亚单位（如外壳的特殊蛋白结构）制成的疫苗。如：乙肝疫苗、HPV（宫颈癌）疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。,优点：副作用小、更为安全、稳定缺点：免疫原性低，需与佐剂合用。,乙肝病毒（HBsAg）,HPV病毒（L1蛋白）,质粒,Recombinant plasmid,Vaccinia 启动子,转染,感染,牛痘病毒,组织培养细胞,同源性重组,筛选,重组牛痘载体疫苗,免疫,表达,基因产物免疫原,免疫反应,减毒微生物,编码病原体抗原D
17、NA,载体疫苗,将有目的基因质粒（plasmid）导入体内（vaccinee ），低效率感染细胞表达抗原。DNA-mediated or DNA-based immunization,核酸疫苗：DNA疫苗、RNA疫苗,（二） 人工被动免疫,人工被动免疫是指将特异性抗体等免疫分子或免疫细胞输入机体，使机体被动获得特异性免疫力。,常用的生物学制品,1、抗毒素,2、人免疫球蛋白制剂,由马免疫血清获得,从人血浆或胎盘血中分离,3、效应细胞、细胞因子,我国计划免疫5苗防7病,我国推行的儿童基础免疫程序,预防接种注意事项：,接种剂量、次数、间隔时间接种途径：皮下注射、皮内注射或划痕、口服、雾化吸入接种后反
18、应：局部可有红肿、疼痛、发痒或有低热、疲倦、头痛等，一般不需特殊处理即行消退，如有严重反应及时诊治。禁忌症：（）严重疾病、急性及慢性感染（）发热（）有过敏者或免疫缺陷（）妊娠妇女,新疫苗的审核： 3期临床试验,I期：以新疫苗的的安全性为主 ；期：以新疫苗的有效性为主；期：证明新疫苗预防传染病的免疫保护性为主。,疫苗的临床试验,针对机体低下或亢进的免疫状态，人为增强或抑制机体免疫功能以达到治疗疾病的治疗方法。,二、免疫学治疗,免疫治疗包括五方面内容,（一）抗体为基础的免疫治疗（二）抗原为基础的免疫治疗（三）细胞为基础的免疫治疗（四）细胞因子为基础的免疫治疗（五）免疫调节剂,免疫学治疗分类,免疫增
19、强疗法免治抑制疗法,影响免疫应答水平,治疗手段的针对性,特异性免疫治疗非特异性免疫治疗,治疗手段的针对性,主动免疫治疗被动免疫治疗,（一）抗体为基础的免疫治疗,抗毒素(antitoxin） 用细菌外毒素多次免疫机体获得免疫马血清，含有大量能中和抗体IgG。如：白喉抗毒素、破伤风抗毒素 用途：治疗、紧急预防人特异性免疫球蛋白 来源：恢复期病人、含高效价特异性抗体的供血者 接受类毒素和疫苗免疫者的血浆丙种球蛋白（g-globulin） 胎盘丙种球蛋白、人血浆丙种球蛋白 来源：健康人静脉血 健康产妇胎盘血（脐血） 用途：用于多种细菌、病毒性疾病的治疗,肿瘤的免疫导向治疗,抗CTLA-4、PD-1、P
20、DL-1抗体,US和EU所批准的治疗性抗体,US和EU所批准的治疗性抗体,（二）抗原为基础的免疫治疗,合成肽表位疫苗重组抗原疫苗DNA疫苗重组病毒疫苗,增强免疫应答：肿瘤、病毒感染性疾病,诱导免疫耐受：AID、超敏反应、移植排斥,治疗性疫苗,针对机体异常的免疫状态，人工给予抗原以增强免疫应答或诱导免疫耐受来治疗疾病,（三）细胞为基础的免疫治疗,将自体或异体的造血细胞、免疫细胞或肿瘤细胞经体外培养、诱导扩增后回输机体，以激活或增强机体的免疫应答。 干细胞移植：骨髓、外周血、脐血干细胞 过继免疫细胞治疗：NK细胞、LAK细胞、CIK细胞、 TIL细胞 DC疫苗：PBMC经IL-4、GM-CSF诱导
21、扩增形成 肿瘤细胞疫苗：失去分裂增殖能力，保留免疫原性 基因修饰的瘤苗：降低致瘤性，增强免疫原性,细胞因子补充/添加疗法 (抗肿瘤、造血、抗感染）IFN- 白血病EPO 肾性贫血,（四）细胞因子及拮抗剂为基础的免疫治疗,细胞因子阻断/拮抗疗法 （抗炎症、排斥反应）,（五）免疫调节剂,免疫增强剂免疫抑制剂,免疫增强剂,用于感染、肿瘤、免疫缺陷病的治疗,（1）化学合成药物,左旋咪唑,能够激活吞噬细胞功能，促细胞因子生成。,西咪替丁,抑制组胺TS细胞的活化,（2）微生物制剂,卡介苗,很强的非特异性免疫刺激作用,短小棒状杆菌,可以非特异性的免疫增强功能,（3）中草药及植物多糖,（4）iRNA:,来源抗
22、原致敏淋巴组织，特异性免疫增强,2. 免疫抑制剂,（1）化学合成药物,（2）微生物制剂,（4）中草药,糖皮质激素,抑制M作用、抑制免疫应答,环磷酰胺,抑制DNA的复制与蛋白的合成,环孢素A,抑制IL-2的生成,FK506,是一种大环内脂类抗生素，作用与环孢素A 类似,效果更强，肾毒性小。,雷公藤多甙,（3）抗体： 抗CD3、抗胸腺抗体等,雷帕霉素,阻断IL-2诱导的T细胞增殖,泼尼松,减少TB细胞数量、增殖,病案讨论,患者张，男，55岁。因张口受限2天来诊。自述1周前被鱼钩刺伤右手拇指，当地医生清创缝合，2天前拆线，遂出现张口受限，颈背疼痛。体格检查：体温38.6度，P112次/分，R25次/分，BP126/76mmHg，神志清楚，张口度0.3cm,咬肌和颈部肌肉张力增高，无全身抽搐；两侧咬肌神经封闭后张口可达正常。实验室检查：血白细胞11109/L，血小板70x109/L，血红蛋白86g/L。初步诊断：破伤风感染。给与破伤风抗毒素34500U/日，肌注地西伴。症状缓解，巩固治疗5日后出院。问题：抗毒素注射属于何种免疫治疗方法？ 抗毒素注射的原则和注意事项？,思 考 题,人工主动免疫、人工被动免疫的优缺点？举例说明各类预防性疫苗的特点与用途（灭活疫苗、减毒活疫苗、类毒素、亚单位疫苗，基因工程疫苗等）。免疫治疗的分类与特点？,谢谢大家,
