1、 苦瓜蛋白诱导 K562/A02 细胞凋亡作者：尹丽慧，熊术道，叶爱芳，韩义香，章圣辉，吴建波【摘要】 目的 ：观察苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞凋亡受抑逆转作用及其分子机制。方法：CCK-8 法测定苦瓜蛋白对耐药细胞K562/A02 的 IC50 值，细胞形态学和 AnnexinV/PI 双染法检测细胞凋亡，流式细胞法测定 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表达及caspase-3 和 caspase-8 活性。结果：苦瓜蛋白显著抑制 K562/A02 耐药细胞的增殖；经苦瓜蛋白处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变，AnnexinV/PI 双染法显示凋亡细胞明显增加；P-
2、gp 蛋白表达下降，caspase-3 和 caspase-8 活性显著增强。结论：苦瓜蛋白能诱导K562/A02 耐药细胞凋亡，逆转耐药白血病细胞 P-gp 高表达所介导的细胞凋亡抑制。 【关键词】 白血病 苦瓜蛋白 多药耐药 凋亡抑制 P-gp caspase-3 caspase-8 Abstract: Objective: To explore the reversal effect of momordin on inhibition of apoptosis in multidrug-resistant K562/A02 cells and its molecular mechanis
3、ms. Methods: The half-inhibition concentration （IC50） of momordin on K562/A02 cells was assessed by CCK-8 assay. Cell apoptosis was determined by Annexin V/PI double-staining and cytomorphology. P-glycoprotein (P-gp)expression，caspase-3 activity and caspase-8 activity were measured with flow cytomet
4、ry (FCM). Results: Momordin obviously inhibited the proliferation of K562/A02 cells. A typical apoptotic change in the morphology was observed in K562/A02 cells after treatment with momordin. An obvious increase in the apoptosis rate of the cells was found with Annexin V/PI staining. And FCM showed
5、P-gp expression obviously decreased while caspse-3 activity and caspase-8 activity markedly increased. Conclusion: Momordin can induce apoptosis of drug-resistance K562/A02 cells，and reverse inhibition of apoptosis in K562/A02 cells is mediated by high expressions of P-gp. Key words: leukemia； Momor
6、din； multi-drug resistance；apoptosis resistance；P-glycoprotein；caspase-3；caspase-8苦瓜蛋白是从苦瓜种籽中分离出来的一种碱性糖蛋白，属于I 型植物核糖体失活蛋白（ribosomal inactivating protein，RIP ），其RNA N-糖苷酶活性能使真核细胞核糖体 28S rRNA 第 4 323 位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而无法与延长因子 2 结合并导致 60S 亚基失活，进而使蛋白质的合成受到不可逆的抑制。近年来，陆续有研究表明，I 型 RIP 具有抗肿瘤作用，而其抗肿瘤作用依赖于其介导的细胞凋
7、亡。我们以往的研究也表明，苦瓜蛋白具有良好的抗肿瘤作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡1-2。Pongnikom 等3研究发现宫颈癌患者在化疗过程中同时服用苦瓜 4590 d，其 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）水平明显下降，而单纯化疗的患者 P-gp 表达没有改变，提示苦瓜中某种成分具有下调 P-gp 表达的作用。但目前有关苦瓜蛋白对耐药肿瘤细胞作用的研究国内外少有报道。本研究以多药耐药(multi-drug resistance，MDR)K562/A02 细胞为模型，从细胞凋亡、P-gp 表达及 caspase 活性等方面研究苦瓜蛋白对 K562/A02的细胞生物学作用，探讨苦瓜
8、蛋白对耐药肿瘤细胞作用的分子机制，以期为白血病多药耐药治疗寻找一种新的药物。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验材料：多药耐药细胞株 K562/A02 购自中国医学科学院血液学研究所；苦瓜蛋白由本实验室提取2。1.1.2 试剂：RPMI1640（美国 GIBCO 公司）；胎牛血清（天津市正江高科技有限公司）；100青霉素- 链霉素双抗液（美国GIBCO 公司）；CCK-8（日本同仁化学研究所）； Annexin V kit（Bender Medsystems 公司）；荧光标记单抗（BD 公司）；caspase-8 kit（联科公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养：K562/A02 细
9、胞用含 10%FBS，100 U 青霉素、链霉素的 RPMI1640 培养液，予 37 、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，长满后按悬浮细胞常规传代法进行传代培养。1.2.2 细胞毒性试验：取对数生长期 K562/A02 细胞，按1105/mL 接种 96 孔板，每孔加 100L，24 h 后分别加入0、2、5、10、20、50 和 100g/mL 苦瓜蛋白，每组 6 复孔，继续培养 48 h，加入 CCK-8，37 孵育 1 h，酶标仪测 OD 值，计算细胞增殖抑制率，IC50。1.2.3 AnnexinV/PI 双染法检测细胞凋亡：取对数生长期细胞，按 1105/mL 接种于 24 孔
10、板，24 h 后分别加入 0、5、10 和15g/mL 苦瓜蛋白，作用 48 h 后，每个标本收集 2105 个细胞，按试剂盒说明书进行操作，用 FACS Calibur 型流式细胞仪检测。1.2.4 细胞凋亡细胞形态学的检测（姬姆氏染色）：取对数生长期细胞，按 1105/mL 接种于 6 孔培养板，分别予 0、5、10 和15g/mL 苦瓜蛋白，药物作用 48 h 后，收集细胞，制成细胞涂片，姬姆氏染色 10 min，镜下观察，拍照。1.2.5 苦瓜蛋白对 P-gp 表达和 caspase-3 活性的影响：取对数生长期细胞，按 1105/mL 接种于 24 孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物
11、作用 48 h 后，每个样本收集细胞（23）105 个细胞，按试剂盒说明书进行操作，用 FACS Calibur 型流式细胞仪检测。1.2.6 苦瓜蛋白对 caspase-8 活性的影响：取对数生长期细胞，按 1105/mL 接种于 24 孔板，阴性对照组加入 Z-VAD-FMK 1L/mL，对照组和苦瓜蛋白组分别加入 0、5、10 和 15g/mL 苦瓜蛋白，每个标本收集 3105 个细胞，按试剂盒说明操作，上机检测。1.3 统计学处理方法样本均数比较采用软件进行单因素方差分析；IC50 采用加权线性回归方法计算。2 结果2.1 苦瓜蛋白对 K562/A02 细胞毒性试验2g/mL 以上的苦
12、瓜蛋白即能够显著抑制 K562/A02 细胞生长（P 0.05），抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈明显的剂量依赖关系（见图 1）；48 h 的 IC50 为（20.90.7）g/mL。2.2 苦瓜蛋白诱导 K562/A02 细胞凋亡0、5、 10 和 15g/mL 苦瓜蛋白处理 K562/A02 细胞 48 h，细胞凋亡率分别为（1.640.27 ）% 、（4.020.51）%、(8.111.00)%和(16.361.47)%，(n =3)，苦瓜蛋白处理组与对照组相比较，差异有显著性(P0.05)，其中，以 15g/mL 组细胞凋亡最明显（见图 2）。细胞涂片姬姆氏染色，光镜下观察发现用药
13、组细胞核染色质浓集、聚集在核膜下呈半月形或指环状，核固缩、碎裂，凋亡小体等典型的凋亡细胞形态学改变（见图 3）。胞保持敏感性，并能促使耐药细胞凋亡。白血病化学治疗中药物诱发的 MDR 常见、主要的机制是耐药蛋白 P-gp 过度表达和细胞凋亡受抑制，对绝大多数常规药物不敏感5-7。近年来的研究表明 P-gp 除通过从细胞内逆浓度梯度排出抗肿瘤药物，降低细胞内药物浓度，使药物无法对白血病细胞构成有效杀死而引起耐药；还通过抑制 caspase 的激活来调节由多种因素诱发的细胞凋亡，特别是依赖 caspase 的激活凋亡途径8-9。我们的研究也证实了 P-gp 蛋白在 K562/A02 细胞中呈高表达
14、状态，且同时存在 caspase-3 和 caspase-8 活性受抑制，提示 P-gp 可能通过抑制caspase 的凋亡通道参与 K562/A02 细胞多药耐药性和凋亡抑制的形成。我们的研究表明，苦瓜蛋白诱导 K562/A02 细胞凋亡的过程中，存在着 P-gp 蛋白表达下调现象，15g/mL 苦瓜蛋白处理后 P-gp 蛋白表达率下降了 30.17%；而 caspase-3 和 caspase-8 活性显著增强，15g/mL 苦瓜蛋白处理后分别升高了 75.39%和 17.12%，因此我们认为苦瓜蛋白能抑制 P-gp 表达，解除 P-gp 对 caspase-3 和 caspase-8的抑制，从而逆转因 P-gp 高表达对 caspase 的凋亡通道的抑制效应而促进耐药细胞凋亡，是苦瓜蛋白诱导耐药白血病细胞凋亡的关键机制。【
