1、 环氧合酶2、p53 在骨肉瘤中的表达及临床意义【摘要】 探讨环氧合酶2（cyclooxygenase2，cox2）蛋白、p53 蛋白在骨肉瘤、骨软骨瘤组织中表达的差异性、相关性及临床意义。方法回顾本科 19982004 年间骨肉瘤患者档案，筛选术后石蜡切片 40 例作为试验组。男 24 例，女 16 例；年龄838（ 18.686.47）岁。筛选同期骨软骨瘤患者术后石蜡切片 20 例作为对照组。男 13 例，女 7 例；年龄 927（17.954.77）岁。应用免疫组化（SP ）进行染色。光镜下观察染色切片，cox 2 蛋白染色：以组织胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞；p53 蛋白染色：以胞
2、核内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。随机观察 5 个高倍视野，依照阳性细胞所占比例分为：“-”阳性细胞所占比例5% ；“+”阳性细胞所占比例 525；“+”阳性细胞所占比例2650 ； “+”阳性细胞所占比例50。分别统计两者的阳性表达情况，所得数据应用 SAS v6.12 统计软件处理。采用chisquare test 进行 x2 检验，=0.05 为水准，分别统计两者在骨肉瘤、骨软骨瘤组织细胞中阳性表达的差异性。采用 Spearman 等级相关分析法检验两者在骨肉瘤中阳性表达之间的相关性，=0.05 为水准。结果骨肉瘤组织中 cox2、p53 蛋白的阳性率分别为67.5和 55.0，显著高于对
3、照组骨软骨瘤组织（P0.05）。cox2、p53 蛋白在骨肉瘤中的表达密切相关（rs=0.58，P0.05）。结论在骨肉瘤中，cox2、p53 参与了骨肉瘤的发生、发展，两者密切相关，相互协同。临床上联合检测两者对骨肉瘤的早期诊断和预后有重要意义。 【关键词】 骨肉瘤 骨软骨瘤 环氧合酶2 p53 疫组化Abstract：ObjectiveTo observe the expressional variability and correlation of cox2 and p53 protein between osteosarcoma and osteochondroma and explo
4、re their clinical significance.MethodSixty Specimens divided into 2 groups were taken from the department of pathology,Third Hospital of Hebei Medical University during 19982004.Among them,40（24 male and 16 female）aged 838（ 18.686.47）at time of therapy were from cases of osteosarcoma excision;20（13
5、male and 7 female）aged 927（17.954.77）from benign lesion of bone（osteochondroma）operation.Immunohistochemistry staining（Streptavidin Peroxidasc,SP method）was performed to detect the expressions of cox2 protein and p53 protein in 40 cases of osteosarcoma.The criteria of positive expression was that br
6、own granule was found in cytoplasm（cox2）or in nucleus（p53）.The percentage of cox2 or p53 positive expression in five high power fields was cunted randomly in each case.Positive（- ）:positive oncocytes account 5%;Positive（+）:positive oncocytes account 5%25%;Positive（+）:positive oncocytes account 26%50
7、%;Positive（+）:positive oncocytes account50%.Software SAS v6.12 was used in data analysis.The difference of cox2 and p53 expressions between osteosarcoma and osteochondroma was analyzed with Chisquare Test.Spearman method was used,with the standard =0.05,to analyze the relationship between cox2 and p
8、53 expression among osteosarcoma.Result The positive rate of cox2 and p53 expressions were 67.5% and 55.0% in osteosarcoma,there was noticeable distinction between osteosarcoma and osteochondroma,most of them was high.There was a positive correlation between them,rs=0.58,P0.05.ConclusionCox 2 and p5
9、3 participate and closely correlate in the carcinogenesis and development of osteosarcoma.The detection of them might be a guide for the pristine diagnosis and prognosis of osteosarcoma in clinic.Key words:osteosarcoma; osteochondroma; eyelooxygenase2; p53; immunohistochemistry骨肉瘤是一种高恶性肿瘤，早期即可发生肺部转移
10、。故骨肉瘤的早期诊断至为重要。近数年来国内外多中心研究证实，cox2，p53蛋白在多系统肿瘤中呈现过高表达，但在骨肉瘤中表达之间的关系少见报道，本实验应用免疫组化方法对此进行了初步研究。1 材料与方法1.1 临床资料收集河北医大三院骨病科 19982004 年间骨肉瘤标本 40 例作为试验组，男 24 例，女 16 例；年龄 838（18.686.47）岁。另筛选同期骨软骨瘤标本 20 例作为对照组，男 13 例，女 7 例；年龄927（ 17.954.77）岁。1.2 免疫组织化学方法（SP 法）1.2.1 主要试剂cox2 羊多克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司）、p53 兔多克隆
11、抗体（美国 Zyme 公司）、SP9003 工作试剂盒，SP 9001 工作试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。1.2.2 试验步骤严格按照 SP 试剂盒说明进行操作。1.3 结果判定由两位病理医生盲法判定，光镜下观察染色切片，以组织胞浆内（cox2）或胞核内（p53）出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，随机观察 5 个高倍视野，依据阳性细胞所占比例分为：“-”阳性细胞所占比例5；“+”阳性细胞所占比例 525；“+”阳性细胞所占比例2650 ； “+”阳性细胞所占比例50%。1.4 统计中处理采用 x2 检验阳性表达的差异性。采用 Spearman 等级相关分析法检验阳性表达之间
12、的相关性，=0.05 为水准。2 结 果2.1 40 例骨肉瘤中 27 例 cox2 蛋白染色显示为阳性（染色位于胞浆中），阳性率为 67.5。20 例骨软骨瘤中仅 3 例显示低阳性结果，阳性率为 15.0（表 1）。两者存在显著性差异，x2=14.7，P0.05 有统计学意义。2.2 p53 蛋白于 22 例染色显示为阳性结果（位于胞核中），且多为高表达，阳性率为 55.0。20 例骨软骨瘤中均未显示阳性结果（表 2）。两者存在显著性差异，x2=17.368，P0.05，有统计学意义。表 1 cox2 在骨肉瘤、骨软骨瘤中的差异性表达情况表 2 p53在骨肉瘤、骨软骨瘤中的差异性表达情况 2
13、.3 40 例骨肉瘤标本中有18 例 cox 2、mtp53 蛋白染色均为阳性（图 1、2），有 9 例染色均为阴性（表 3）。通过 Spearman 等级相关分析法证实两者存在显著正相关，rs=0.58，P 0.05，有统计学意义。 表 3 cox2、p53 在骨肉瘤中的相关性表达情况注：rs=0.58,P 0.053 讨 论近年来国内外多中心研究显示：cox2、p53 在多系统肿瘤均存在高表达，参与了肿瘤的发生、发展和转移，但在骨肉瘤中的相关研究少见报道。本研究主要探讨 cox2、p53 在骨肉瘤的关系，为骨肉瘤的早期诊断、预后提供一种新的方法和标志。cox 具有两种分型：环氧合酶型（co
14、x1）和环氧合酶型（cox2）两种同工酶，cox 1 是一种结构型酶，微量恒定表面在人体正常组织细胞中，参与机体正常生理过程，cox2 是一种诱导型酶，在生理细胞中基本不表达，在细胞受到各种刺激下迅速合成，参与多种生理及病理过程。Dickens 等1对 58 例骨肉瘤和横纹肌肉瘤的组织进行了免疫组化研究，发现 cox2 在 82.8的组织中表达阳性，且随着骨肉瘤和横纹肌肉瘤恶性程度和侵袭力的增高其表达率有增高的趋势。Maciag A 等2对肺癌组织研究认为，突变型 Krasv 12 导致 cox2 水平明显上调，致使 ROS 增多出现 DNA损伤，诱导细胞恶性变，同肺癌的发生、发展密切相关。X
15、u Z 等3研究认为，cox 2 在骨肉瘤中组织细胞中的过高表达，可通过增高 ROS 水平，降低细胞的生长能力而达到阻滞肿瘤细胞增殖，并且这种作用与肿瘤组织、细胞的种类有关。但本研究并未发现这种情况，在骨肉瘤中 cox2 蛋白均呈过高表达，与肿瘤的组织类型无关。姜宇等4研究表明，骨肉瘤组织中存在 cox2 的高表达，cox2 与骨肉瘤的新生血管生成密切相关，其高表达可能促进了肿瘤新生血管生成。本研究表明，骨肉瘤的发生、发展与 cox2 的表达存在密切相关，与国内、外的相关肿瘤文献报道结果一致5。人类肿瘤中约有 50以上与 p53 基因的变化有关。p53 基因分为野生型（wtp53）和突变型（m
16、tp53）2 种，其产物亦分为野生型 p53 蛋白和突变型 p53 蛋白 2 种。野生型 p53 蛋白极不稳定，半衰期仅为数分钟，对控制细胞周期、维持细胞遗传稳定性具有重要作用，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用。p53 基因突变和等位基因缺失是导致 mtp53 蛋白异常表达的主要原因。由于mtp53 蛋白的半衰期可延长至 612 h，所以用抗 mtp53 蛋白的抗体通过免疫组化的方法检测肿瘤组织，过高表达常提示 p53 基因存在错义突变。突变型 p53 基因则具有癌基因作用，促进细胞恶性转化。Singh 等6研究发现 p53 基因参与了 PI3KPIP3PKB 诱导的凋亡途径。由此可推知
17、，当 p53 基因由野生型突变为突变型时其诱导凋亡的功能丧失，大大增强了肿瘤细胞的增长。本研究中p53 蛋白在骨肉瘤中呈现过高表达，在骨软骨瘤中均未表达，符合p53 作为肿瘤抑制基因在恶性肿瘤中的表现。cox2 蛋白、 mtp53 蛋白在骨肉瘤中的表达及其表达的相关性在国内外均未出现报道，Corcoran 等7对结肠肿瘤研究认为，p53 上调了 cox2 的表达，反过来， cox 2 阻滞了 p53 依赖性转录，从而导致 p53 削弱了自身的抗肿瘤，促进肿瘤细胞凋亡的作用，突变性 p53 蛋白同 cox 2 蛋白的表达水平呈正相关。Legan M 等8研究认为，cox 2 的过高表达在胆囊癌早
18、期既已出现，且同野生型 p53 突变明显相关，两者之间存在相关性。本研究证实，cox2，mt p53 在骨肉瘤组织中均呈现过高阳性表达，且证实cox2 蛋白、 mtp53 蛋白在骨肉瘤中的阳性表达情况存在显著正相关，与上述相关文献结果近似。这说明它们的并存对于骨肉瘤的发生、发展起到了协同的作用。两者与骨肉瘤远处转移之间的关系有待进一步研究。cox2 可作为骨肉瘤靶向治疗的新靶点，特异性 cox2 抑制剂的出现为骨肉瘤的治疗提供了一条新的途径。冯尔宥等9研究表明 cox2 特异性抑制剂噻莱昔布能够明显抑制骨肉瘤细胞的生长，从另一角度证明 cox 2 与骨肉瘤的发展有显著关系。本研究结果认为临床上联合检测 cox2 蛋白、mt p53 蛋白，对骨肉瘤患者的早期诊断和预后具有重要意义。两者有望成为骨肉瘤的潜在标记物。【
