1、 活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子 mRNA 表达的影响 【摘要】 目的观察活血熄风方对局灶性脑缺血模型大鼠脑梗塞体积及脑组织中血管内皮生长因子（VEGF mRNA）表达的影响。方法ethodsale rats ly divided into six groups: sham group, model group, HXR treated group(20，10，5 gkg-1 as high，middle and loodipine control group(0.02 gkg-1). The model of FCI istry initiation of thrombosis
2、, intragastric administration continued 7 days before modeling and draaterial after 24h. Infarction volume RNA erase chain reaction(RT-PCR). ResultsThe infarction volume RNA odel rats (P0.05 or P0.01).ConclusionHXR can decreased infarction volume and has a protective effect on FCI rats, and the mech
3、anism may be related to increasing the expression of VEGF mRNA.Key istry; VEGF mRNA; RT-PCR; Focal cerebral infarction脑缺血后，由于脑组织缺血、缺氧，缺血中心区细胞迅速死亡，半暗区神经细胞处于低氧、低灌注状态，及时恢复该区域血流供应有望改善患者的神经功能。而半暗区血流的恢复有赖于侧枝循环的建立，血管再生是决定这些细胞存活的关键因素，与缺血性脑卒中病人的预后关系密切1。在血管再生过程中，众多因子参与调节，血管内皮生长因子(vascular endothelial groRNA 的
4、表达以及活血熄风方对上述方面的干预作用，来探讨活血熄风方脑保护的作用机制。1 材料与仪器1.1 动物健康雄性 in/次，两次煎液混匀，旋转蒸发仪分别浓缩至 2，1，0.5 gml-1，4保存备用。尼莫地平片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产，每片 20 mg，使用前用蒸馏水溶解成含量为 2 mgml-1 的混悬液。 1.3 试剂与仪器 Trizol Reagent（美国 Invitrogen）；DNA Marker DL2000、Taq 酶、Ribonuclease inhibitor、dNTP Mixture（大连宝生物）；M-MLV Reverse Transcriptase（美国 P
5、romega）；玫瑰红(美国 Sigma) ；红四氮唑(TTC) （化学纯，北京化工厂）。梯度 PCR 系统（ICYCLER 型，美国 BIO-RAD 公司）；DXY-2稳压稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（Gel Doc 2000 型，美国 BIO-RAD 公司）；低温高速离心机（Sigma3k30，德国 Sigma 公司）；紫外分光光度仪（ UV-1601 型，日本岛津）；立体定位仪（美国 Stoelting 公司）； IPP 图像采集分析系统（美国）。2 方法2.1 分组与给药大鼠随机分为 6 组：假手术组、模型组、活血熄风方高剂量组、活血熄风方中剂量组、活血熄风低剂量
6、组、尼莫地平对照组，每组 12 只，其中 6 只用于 TTC 染色，6 只用于 RT-PCR。各组均给予手术造模，假手术组股静脉注射药物为生理盐水，其余操作同模型组。各组造模前 7 d 灌胃给药，活血熄风方高、中、低剂量组分别给予活血熄风方 20，10，5 gkg-1d-1，对照组给予尼莫地平 0.02 gkg-1d-1，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。1 次/d，末次给药 1 h 后造模。2.2 局灶性脑缺血性大鼠模型的制备采用光化学法诱导制备局灶性脑缺血性大鼠模型，根据-MLV 催化合成 cDNA。VEGF mRNA和内参照酸性核糖体磷蛋白 P0(Acidic ribosomal p
7、rotein P0，Arbp)引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成。引物序列如下：VEGF ：5- TGGACCCTGGCTTTACTGCTG -3 （上游），5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA -3（下游），扩增片段为 127bp；Arbp： 5- GCGTCTGTCTGCAGATTGGCTA -3 (上游) ， 5-CAGATGGATCGGCCAGGAA -3(下游)，扩增片段为 150bp。采用50l 反应体系进行扩增，反应参数为：Arbp95预变性 4 min，94变性 30 s，60退火 30 s 30 个循环，72终末延伸 4 min。VEGF：954 min，943
8、0 s，6030 s，7220 s35 个循环；72终末延伸 7 min。2.4.3 半定量分析扩增产物采用 2%琼脂糖凝胶电泳，在电压为 5Vcm-1 及稳流的条件下进行电泳，用 Quantity One 分析软件进行光密度扫描，测定各组 PCR 产物密度值与内参照 Arbp PCR 产物密度值。用各组目的基因片段（VEGF ）密度值 /内参基因片段（Arbp）密度值的比值进行比较。 2.5 统计学方法应用SPSS13.0 统计软件进行统计处理，所有数据均用s 表示，各组间比较采用单因素方差分析，成组数据比较采用 t 检验，以P0.05 为具有统计学意义。3 结果3.1 活血熄风方对局灶性脑
9、缺血大鼠脑梗塞体积的影响大鼠脑组织经 TTC 染色后，除假手术组外均在照射区大脑皮层出现白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，边界清晰，冠状面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向侧脑室，深达皮质全层，表明造模成功。活血熄风方各剂量组及尼莫地平组脑梗塞灶体积均较模型组减小，统计学差异显著(P0.01)。活血熄风方各剂量组与尼莫地平对照组比较，无明显差异（P0.05 ）。结果见表 1，图 1。表 1 活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响（略）3.2 活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑组织 VEGF mRNA 表达的影响与假手术组比较，模型组 VEGF mRNA 表达有所升高（P0.01）。与模型组比较，活血熄风方
10、各剂量组与尼莫地平组均可显著上调脑组织 VEGF mRNA 的表达（P0.01），且活血熄风方各剂量组 VEGF mRNA 表达相对含量均明显高于尼莫地平对照组（P0.01 ）。见表 2，图 2。表 2 对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞边缘区 VEGF mRNA 表达的影响（略）4 讨论在缺血性脑血管疾病的研究中人们注意到，VEGF 及其受体的促血管形成作用对缺血半暗区血供的改善和侧枝循环的建立具有重要意义。VEGF 是内皮细胞特异性的有丝分裂原，具有促进内皮细胞增殖，提高血管通透性等生物学特性。脑缺血后，低氧可激活 VEGF及其受体系统，促使缺血半暗区 VEGF 表达， VEGF 诱导大量新生血管形
11、成，促进血管增生，增加受累组织的血流灌注和供氧量，减少神经元的凋亡和死亡，减轻脑损伤程度6。目前发现 VEGF 主要有 Flkl 和 Flt 两个特异性受体，其中 Flkl 是发挥生物活性的主要受体7，VEGF 与其受体结合后在血管生成和神经保护方面发挥着重要作用8。当脑缺血时，VEGF 表达增强，并特异性与 Flkl 结合发挥作用。刘氏等9采用原位杂交方法，结果显示，VEGF mRNA 主要在缺血半暗区神经元表达，同时在胶质细胞和血管内皮细胞亦有表达。缺血后 48 h 半暗区周边出现血管增生，并逐渐向中心区延伸，于缺血后 7d 达高峰，整个缺血半暗区可见明显血管增生。近年来，研究人员开始尝试
12、利用生长因子能够促进血管发生及生长的原理，治疗缺血性血管疾病。目前的治疗性血管新生方法中最常用的是外源性促血管生成生长因子的基因治疗与重组蛋白质治疗，但均存在一定限制和困难10，11。中医学认为，缺血性中风的病机特点是气血逆乱，“血菀于上”，即淤血不通，脑脉痹阻，因此临床常采用活血之法，而活血可祛淤，淤血去则新血生，称之“祛淤生新”。生新不仅是传统意义上的生新血，应当还包含有生新络的含义，淤血去则新血及新络生，生新又反过来促进淤血的祛除，这与治疗性血管新生有相同之处。VEGF 是已知作用最强和特异性最高的促血管生长因子，因此也是体现“祛淤生新”的重要指标。本实验 TTC 染色发现，与假手术组相
13、比，光化学法诱导的局灶性脑缺血模型大鼠大脑皮层出现明显的梗塞灶（P0.01），同时发现梗塞区周围脑组织 VEGF mRNA 表达有所升高（P0.01）。而与模型组相比，活血熄风方各剂量组能明显减少梗塞灶体积（P0.01），同时明显上调 VEGF mRNA 的表达（P 0.01），且明显优于尼莫地平对照组（P0.01）。活血化淤治疗脑缺血的一个重要方面是祛淤血生新络，本实验采用具有活血作用的活血熄风方，从器官水平上观察了活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响，从基因水平上观察了对脑组织VEGF mRNA 表达的影响。本实验结果显示，活血熄风方可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞体积，具有明显的脑保护作用，其作用机制可能与增强局灶性脑缺血大鼠梗塞周围脑组织 VEGF mRNA 表达，从而促进缺血半暗带区的血管新生有关。 【
