1、 基于图像分析的 DNA 定量分析研究【关键词】 DNA摘要：目的运用 ICM（Image Cytometer）对图像进行处理和分析，在给出细胞形态学参数的同时对 DNA 的含量进行定量分析，能有效地协助医生对诸如肿瘤等多种病症做出诊断。方法以武汉大学光谱与成像仪器工程技术研究中心研制的“全自动 DNA 细胞图像定量分析仪”（DNAICM）为平台，对鸡血红细胞和宫颈脱落细胞进行液基薄层制片，用 Feulgen 染色法染色，对 DNAICM 上获取的细胞染色图像进行扣背底算法处理。结果 用冷酸解法对两种细胞进行Feulgen 染色后细胞着色较深且均匀；进行扣背底算法处理后的细胞图像的灰度值方差为
2、 0.524，比不进行处理时（0.919）要小。 结论冷酸解法更适用于鸡血红细胞和宫颈脱落细胞的 Feulgen 染色；扣背底算法可以有效地减少视场不匀带来的误差。 关键词：DNAICM ； DNA 定量分析； 扣背底； 积分光密度； DI 直方图； Feulgen 染色Research of DNA Quantitative Cytology Based on Image ProcessingAbstract：ObjectiveImage processing and analyzing by use of ICM（ Image Cytometer）can be conductive to
3、doctors in tumor diagnoses. MethodsMonolayer of chicken red blood cells and cast-off cervical cells were deposited onto microscopic slides by liquid based sampling preparation. The slides were stained by Feulgen coloration for determination of amount of DNA using an automated DNA imaging cytometer (
4、made by Engineering Research Center of Spectrum Imaging Instrument, Wuhan University) and cell images obtained were processed by the method of distracting background in image processing.ResultsThe color of two types of cells after cold acidolysis used in Feulgen coloration was deeper and more symmet
5、rical than that after hot acidolysis. The gray scale variance of cell images after disposure of distracting background was smaller than that of no such disposure. ConclusionCold acidolysis was more suitable in Feulgen coloration of chicken red blood cells and castoff cervical cells. Method of distra
6、cting background could effectively diminish the asymmetry of the background of cell images.Key words：DNAICM ; DNA quantitative cytology ; Distracting background; Integral optical density; DI table; Feulgen coloration 20世纪 90 年代初至今，计算机成本的下降以及性能的大幅度改进、CCD 技术和图像处理技术的发展，使得 ICM 技术在癌症早期诊断的细胞 DNA 定量分析技术中异军
7、突起。其原理是医学病理上常用的细胞切片、印片或涂片，经固定液固定后用 Feulgen 染色，利用精密透射光学显微镜、窄带干涉滤光片、高精度图像采集系统将细胞 DNA 的数字化灰度图像摄入计算机，通过图像处理技术对该细胞 DNA 图像灰度形态进行定量分析，计算出每个细胞的积分光密度（IOD）值，再根据 BeerLambert 光吸收定律将单个细胞的 IOD值与标准定标细胞相比后，换算成细胞 DNA 的绝对质量并给出被测细胞的倍体分布及细胞周期（即 G0/G1 期，S 期，G2/M 期）等参数。医师借助这些参数即可作出诊断。此方法简便、实用而且准确度高，对人体及其它动物肿瘤或癌症的早期病理分析和诊
8、断研究具有重大参考意义。ICM(Image Cytometer)不仅能对极少量的细胞核作 DNA 含量和倍体分析，而且可同时测量细胞核的形态参数（面积、形态因子、纹理特征等）并通过图像处理技术加以辅助分析。因此 ICM 及其仪器在国际上逐步在病理诊断学、细胞生物学、组织胚胎学、遗传免疫学等领域得到了越来越广泛的应用，已经成为DNA 定量测量，尤其是肿瘤的细胞学诊断的一项快速、客观、有效的重要手段1，2 。近几年来，用 DNA 倍体分析系统进行宫颈癌及癌前病变的诊断在国外已有大量报道310 。此外，细胞DNA 定量分析诊断方法在北美及欧洲已作为一种常规临床检测方法之一 1113。1 材料与方法1
9、.1 材料宫颈脱落细胞样本取自湖北省武汉市肿瘤医院、湖北省黄石市第一医院和山东淄博计划生育研究所，保存于 50%的乙醇溶液（细胞保存液）中。鸡血红细胞取自健康公鸡的动脉血，加入 0.3%0.4%的柠檬酸钠抗凝剂，保存于 50%的乙醇溶液（细胞保存液）中。1.2 方法采用液基薄层制片技术，对制作的玻片进行 Feulgen染色，再利用全自动 DNA 细胞图像定量分析仪完成对细胞图像的采集、处理和 DNA 定量分析。1.2.1 液基薄层制片 在细胞保存液中加入 0.1%DTT 消化液放在振荡器上振荡 2 h,然后将消化后的细胞悬液离心 5 min(800 r/min)，弃上清液后加入 50%乙醇分别
10、清洗、离心 2 次(800 r/min5 min/次)。然后将用保存液稀释的细胞混悬液放入细胞涂片离心机甩片 5 min,制成薄层细胞学玻片14 。1.2.2 Feulgen 染色 固定液：10%缓冲福尔马林液（pH 7 .4）；酸解液：盐酸，浓度 5mol/L；酸解温度：25(与武汉四五月份室内温度基本接近)；酸解时间： 45 min；测量滤色镜波长：560 nm。染色过程： 涂片空气干燥 1 h，固定液固定 1 h；蒸馏水漂洗 10 min；5 mol/L HCl， 25酸解 45 min，(温控水浴) ；蒸馏水漂洗 5 min；与 Schiff 染液反应 45 min (25)；蒸馏水漂
11、洗 5 min；自来水冲洗 15 min (稳水)，常规乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封固15，16 。1.2.3 DNA 定量分析 全自动 DNA 细胞图像定量分析仪的系统构成及分析流程 ：武汉大学光谱与成像仪器工程技术研究中心自主开发的全自动 DNA 细胞图像定量分析仪硬件系统由 Olympus BX41 显微镜、恒流源、自动上下片系统、精确位移三维平台(包括载物台、步进电机、三轴原点定位传感器、条码扫描器等)、CCD 摄像机、操纵杆、控制器和、计算机等组成（见图 1）。软件系统自动聚焦、扫描、图像采集程序(卢国强. ICM 分析自动化及应用研究.武汉大学硕士学位论文)，细胞图像数据库、细胞特
12、征库、知识模型库和智能分析处理程序(张燕. 遗传算法和支持向量机在 DNA 细胞图像分析仪中的应用.武汉大学硕士学位论文)，六大功能模块构成。分析流程如图 2 所示。图 1 全自动 DNA 细胞图像定量分析仪硬件构成 （略）图 2 DNA 定量分析的流程（略）扣背底算法 ：为了克服光学传递中的不均匀性，我们采集了一幅空视野作为亮场背底图像，然后在后面采集的细胞图像中除去这个背底图像，用这种方法可以有效地减少视场不匀带来的误差。全局扣背底为测量细胞图像分析仪的光均匀度，在玻片上寻找一个空白位置（染色后的背底，一般还会有少量的杂质）采集一幅背底图像，背底图像的灰度分布不均匀（见图 3），其灰度直方
13、图也不是规则的单峰，这是与显微镜的光路系统直接相关的，如果不采用软件系统进行校正，会带来极大的测量误差。均匀度指背景光强的灰度标准差和变异系数（coefficient of variation）。它们描述了背景光的均匀性，要求背景图像的像素点灰度变异系数小于 3%。其公式如下：sd=1 MNM i=1N j=1fij(x,y)- f(x,y)21/2 （1） CV=sd f(x,y) 其中 sd 为图像各个像素灰度的标准差，fij( ，y) 为某一个像素点的灰度值（0255）， f(x,y)为图像所有像素灰度的平均值， M，N 分别是图像的长和宽。 cv 为图像各个像素灰度的变异系数。图 3
14、采集的背底图像 （略） 图 4 背底图像分割效果图 （略） 图 5 变异系数（略）由图 4 可见，由于背底图像的灰度分布不均匀，二值化后的图像存在不规则边缘（图中蓝色表示背景中灰度值较小的区域）。图 5 中，其直方图的第 1 个峰为某处视场进行扣背底后计算的像素点灰度值变异系数（1.08%），第 2 个峰为未扣背底计算的变异系数（3.82%），第 3 个峰为标准规定的变异系数最大值（3% ）。扣除局部背底的方法与全局扣背底类似。一般是将细胞的外接矩形扩展2 个像素，然后在此范围内计算除了细胞的有效像素之外的所有背景像素的灰度平均值，并以此平均值作为平均背底在细胞的每个有效像素中扣除。扣除算法可
15、以用相除或相减（本 DNAICM 程序中用相除）。由于鸡血红细胞比宫颈脱落细胞小得多，且有的细胞连接较紧密，采用将细胞的外接矩形扩展 2 个像素的方法会使外扩区域中包含其他鸡血红细胞的有效像素，从而在计算积分光密度时产生误差，所以采用外扩 1 个像素的方法。2 结果2.1 冷酸法 Feulgen 染色后的效果 20 倍镜下经 45 min 酸解的鸡血红细胞在全自动 DNA 细胞图像定量分析仪中采集的图像如图68 所示。由图可见，细胞边缘清晰，着色均匀，效果优于热酸法。图 6 原始细胞图像（略） 图 7 背底图像（cv=1.62%）（略） 图 8 全局扣背底后的图像（略）2.2 20 倍镜下鸡血
16、红细胞积分光密度直方图的比较 20 倍镜下经 45 min 酸解的鸡血红细胞（十个视场，共 1500 个细胞）分别按照下面四种不同的方法进行实验，并比较实验结果（见图 9）。结果见表 1。由表 1 可以得出：IOD 离散程度全局扣背底加局部扣背底时最小。理想的玻片背底是均匀的，但实际上由于经 Feulgen 染色后玻片上残留染色物质的分布不均和照明光源的不均匀性，使得玻片背底实际的灰度分布不均匀。如果不扣除这种不均匀性，在玻片不同位置或者是视场的不同位置测得的相同细胞核的灰度值不同，计算出的 IOD 值也会受影响。而全局扣背底大体上去除了背景的不均匀性造成的影响。再进行一次局部扣被底，把背景不
17、均匀性的影响再次减小，所以此时得到的 IOD 的主峰紧密程度最好，离散程度最小；IOD 方差各不相同，其中全局扣背底比不全局扣背底所得的方差要小。这也是由于全局扣背底大体上去除了背景的不均匀性造成的影响。表 1 4 种扣背底方法的比较（略）图 9 （略）（1）全局扣背底、局部扣背底后的细胞 IOD 直方图；（2）全局不扣背底、局部扣背底后细胞 IOD 直方图；（3）全局扣背底、局部扣背底后的细胞 IOD 直方图；（4）全局不扣底、局部不扣背底后的细胞 IOD 直方图。坐标系中横坐标表示 IOD 值，纵坐标表示细胞个数2.3 宫颈脱落细胞 DI（DNA Index,DNA 指数）直方图、散点图
18、20 倍镜下的正常人体宫颈细胞和发生癌变的人体宫颈细胞（全局扣背底、局部扣背底）DI 直方图、散点图的比较（见图 10）。图 10 （略） （1）、（2）正常人体宫颈细胞直方图和散点图；（3）、（4）发生癌变的人体宫颈细胞直方图和散点图直方图中横坐标表示 DI 值，纵坐标表示细胞个数；散点图中横坐标表示 DI 值，纵坐标表示细胞核面积由于宫颈脱落细胞比鸡血红细胞大得多且 DNA 含量较稳定，所以正常人体细胞 IOD 直方图中 IOD 值的离散程度更小（约 90%的细胞在主峰的正负 10%范围内），DI 值的主峰更细，系统测量的结果更精确。由于发生癌变的细胞中 DNA 含量增加，DI 值大于 2
19、 的细胞个数明显增多，医生可以根据 DI 值来判断细胞的癌变程度并作出诊断。3 结论细胞 DNA 定量分析对从硬件平台到软件算法都有着极为严格的要求，以保证定量分析的精度和诊断结果精确性。DNA 定量分析的关键是对细胞的积分光密度和形态学参数（面积、形状因子等）的准确测量。其中第一步就是要获取准确、清晰的图像，这就对细胞制片和染色环节提出了严格的要求。液基薄层制片技术的运用，Feulgen 染色中冷酸法的选择保证了所制玻片完全满足 DNA 定量分析的需要。在细胞积分光密度和形态学参数测量之前对细胞图像进行扣背底处理，很好的消除了显微镜光路系统带来的测量误差，克服了光学传递中的不均匀性，使得细胞积分光密度的测定更加精确。
