1、 基于 Sol-gel 膜和多壁碳纳米管/ 铂纳米颗粒增效的电流型 L-乳酸生物传感器作者：贺晓蕊 于京华 葛慎光 张秀明 林青 朱晗 封烁 袁靓 黄加栋【摘要】 构建了基于多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）和铂纳米颗粒（Pt-nano）的电流型 L-乳酸生物传感器。将 Sol-gel 膜覆盖在 L-乳酸氧化酶（L-lactate oxidase，LOD ）和 MWCNTs/Pt-nano 修饰的电极表面。实验结果表明：传感器的最佳工作条件为：检测电压 0.5 V；缓冲液 pH 6.4；检测温度 25 。此传感器的响应时间为 5 s， 灵敏
2、度是 6.36 A/（mmol/L）。连续检测星期其活性仍保持 90%，线性范围为0.22.0 mmol/L，且抗干扰能力强。在实际血样的检测中，此传感器与传统的分光光度法具有很好的一致性。 【关键词】 生物传感器； L-乳酸； 溶胶 -凝胶； 铂纳米颗粒； 多壁碳纳米管Abstract An electrochemical L-lactate biosensor was fabricated by combining Platinum nanoparticles(Pt-nano) with multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs).L-lactate oxi
3、dase(LOD) was immobilized on the surface of the glassy carbon electrode(GCE) modified with MWCNTs and Pt-nano.The surface of resulting LOD/MWCNTs/Pt-nano electrode was covered by a thin layer of sol-gel to avoid the loss of LOD and to improve the anti-interference ability.The cyclic voltammetric res
4、ults indicated that MWCNTs/Pt-nano catalyst displayed a higher performance than MWCNTs.Under the optimized conditions，i.e.，applied potential of 0.5 V，pH 6.4，25 ，the proposed biosensors determination range was 0.22.0 mmol/L，response time was within 5 s，and the sensitivity was 6.36 A（mmol/L）.It still
5、kept 90% activity after 4 weeks.The fabricated biosensor had practically good selectivity against interferences.The results for whole blood samples analyzed by the present biosensor showed a good agreement with those analyzed by spectrophotometric method.Keywords Biosensor； L-lactate； ol-gel； latinu
6、m nanoparticles； ulti-walled carbon nanotubes1 引言临床医学、牛奶工业、葡萄酒工业、生物技术和运动医学等领域都需要灵敏、快速的 L-乳酸检测方法。特别是血乳酸水平能够反映人体的多种病理状态。传统的 L-乳酸的检测主要采用分光光度计法1。但这种方法过程复杂、成本高。生物传感器因其选择性高、响应快和重复性好等优点被认为是最适合的生化分析仪器之一。目前，关于检测乳酸含量的电化学传感器已有报道2，3。但简便、便宜和选择性高的L-乳酸传感器依然是目前研究的热点。碳纳米管（Carbon nanotubes，CNTs ）拥有许多特殊性质，如高电导性、高化学稳定性
7、，以及非常高的机械强度和系数4，5。CNTs 包括单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs ）和多壁碳纳米管（ Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）。当被用作电化学反应的电极材料时，SWCNTs 和 MWCNTs 都有提高电子转移反应的能力。研究表明：MWCNTs 可增强电极表面的电催化活性和增大其表面积6。文献7表明：CNTs 修饰的电极能够显著增强儿茶酚胺神经传递素、细胞色素 C、抗坏血酸、NADH 和肼复合物的电化学性能。CNTs 能够提高 NADH 和 H2O2 的电子转移反应，这表明它在基于脱氢酶和
8、氧化酶的电流型生物传感器方面有广阔的应用前景。铂纳米颗粒（Patinum nanoparticles，Pt-nano）是一种有效的酶传感器的构建材料。它具有很好的生物相容性、大的表面积及对 H2O2 的催化能力强 11。本研究构建了基于 MWCNTs 和 Pt-nano 的电流型 L-乳酸生物传感器。为阻止电极表面上的酶分子的丢失和提高传感器的抗干扰能力，采用 Sol-gel 膜 12，13覆盖 LOD/MWCNTs/Pt-nano 电极表面。对构建的生物传感器的检测范围、响应时间、敏感性和稳定性进行了研究。考察了 pH 值、电位、温度和电活性干扰物对传感器电流的影响， 并将此传感器应用于全血
9、分析。2 实验部分2.1 试剂与仪器L-乳酸氧化酶（LOD ，E.C.1.1.3.2 ，34 units/mg，from Pediococcus species）、二甲基亚砜（DM）、正硅酸四乙酯（TEOS，99%）、Triton X 100 均购自 Sigma 公司；L-乳酸、L-乳酸锂购自 Fluka 公司；多壁碳纳米管（MWCNTs，直径约 15 nm，纯度 95%，中科院成都有机化学研究所）；氧化铝粉末（Merck 公司）；H2PtCl66H2O（天津市第二化学试剂有限公司）；磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4，0.1 mol/L KC
10、l）作为支持电解质。其它试剂均为分析纯，无需纯化直接使用。实验用水为去离子水。电化学测试在 283 电化学工作站（EG G，USA）上进行，使用 270 软件。采用传统的三电极体系：Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano 修饰的玻璃碳电极（Glass carbon electrode，GCE，=3 mm）作为工作电极，铂片作为对电极，Ag/AgCl 作为参比电极。电流的测定是在搅拌的条件下进行的。2.2 Sol-gel 标准溶液、纳米铂溶液和 MWCNTs 标准溶液的配制在烧杯中按照一定的比例加入 TEOS，H2O 和 0.1 mol/L HCl，不停地搅拌该混合溶液直到溶液变清
11、澈，即得 Sol-gel 储备溶液。此储备溶液被应用于整个实验中，并可根据需要对其进行稀释。根据文献14制备 Pt-nano 溶液。将 4 mL 5% H2PtCl66H2O 溶液加入到 340 mL 蒸馏水中，在 80 下边搅拌边加热。加入 60 mL 1%柠檬酸钠溶液后，在（800.5） 保温 4 h。此过程通过吸附光谱记录。当 PtCl6 的吸附带消失的时候， 表明反应结束。图 1 Pt-nano 的 TEM 图（放大倍数 100000）（略）Fig.1 Transmission electron micrograph of platinum nanoparticles(Pt-nano)
12、(100000)将 2 mg MWCNTs 加入到 1 mL 二甲基亚砜溶液中，超声搅拌，制备成黑色悬浊液状的 MWCNTs 溶液。2.3 制备 Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano 修饰的酶电极用 0.05 m Al2O3 粉打磨玻碳电极，超声清洗，再分别用 1 mol/L HNO3 和 1 mol/L NaOH 清洗，然后用双蒸水彻底清洗。20 L MWCNTs 和 20 L 铂纳米颗粒混合制成贮备溶液，超声 40 min，得到均匀分散的 MWCNTs 和 Pt-nano 溶液。将 10 L MWCNTs 和 Pt-nano 溶液滴加到玻璃碳电极的表面，使之均匀分布在电极的
13、整个表面上，然后将电极在室温下干燥 30 min。再用 2 L LOD 溶液覆盖 MWCNTs 和 Pt-nano 复合膜修饰的电极表面。在室温下干燥 20 min 后，加 6 L Sol-gel 储备溶液到酶层的表面，然后在室温下干燥。最后，将酶电极浸入到 pH 6.8 的缓冲液中，保存在 4 的冰箱中过夜，以便除去电极表面过量的 L-乳酸氧化酶。用去离子水彻底清洗电极，即得 Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano 修饰的电极。3 结果与讨论3.1 Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano 修饰电极的电化学特性研究了 MWCNTs/Pt-nano 和 MWCNTs
14、修饰的电极对 L-乳酸的电催化行为。由图 2 可见，MWCNTs/Pt-nano 和 MWCNTs 都能增加传感器的电流响应。 图 2 裸电极(a)、MWCNTs 修饰的电极（b）、MWCNTs/Pt-nano 修饰的电极(c)的 CV 图（略）Fig.2 Cyclic voltammograms of L-lactate on bare GCE(a)，MWCNTs modified electrode(b)，MWCNTs/Pt-nano modified electrode(c)1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)，扫描速率(Scanning rate) 50 mV/s， 0.1
15、 mol/L PBS，电压（Polential） 5 V，pH 6.4.但是MWCNTs/Pt-nano 修饰的电极显示出比 MWCNTs 修饰的电极有更好的电流增效作用。由图 2 中曲线 b 和 c 可见，MWCNTs/Pt-nano 修饰的电极对 L-乳酸的电催化活性比 MWCNTs 修饰的电极强。因为MWCNTs/Pt-nano 修饰电极的电化学性能得到了提高，电子能够更容易快速地在酶和 MWCNTs/Pt-nano 层之间传递。3.2 pH 值对传感器响应的影响研究了 pH 值在 5.68.0 范围内变化对传感器电流响应的影响（图 3）。不同 pH 值的 L-乳酸标准溶液的浓度均为 1
16、 mmol/L。实验表明： pH6.4 时，传感器的响应电流随着 pH 值的增大而显著增大； pH=6.4 时，传感器的响应电流达到最大；pH6.4 时，传感器的响应电流下降。本实验选择 pH 6.4 的缓冲液作为检测 L-乳酸的缓冲液。3.3 温度对传感器响应的影响在 pH 6.4 的缓冲液中，研究了 550 范围内温度对传感器响应电流的影响（图 4）。在 525 范围内，随着温度的提高，传感器的响应电流逐渐增大; 在 25 条件下，反应达到最大值; 然后随着温度的提高，传感器的响应电流快速下降，这可能是因为高温使酶变性造成的。在较高的温度下，蛋白质的三维结构被破坏，酶分子的构象被打开，从而
17、失去了活性15。图 3 缓冲液 pH 值对传感器响应的影响（略）Fig.3 Effect of pH of buffer solution on response of biosensor1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； 0.5 V. 图4 温度对传感器响应的影响（略）Fig.4 Effect of temperature on response of biosensor1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； pH 6.4； 0.5 V.3. 电流反应和工作曲线在上述优化条件下，探讨生物传感器对 L-乳酸
18、的响应。实验在搅拌的 0.1 mol/L pH 6.4 的缓冲液中进行。图 5a 和图 5b 分别为在未加入 Pt-nano（A）和加入 Pt-nano（B）的情况下酶电极的电流响应的标定曲线。实验结果表明：修饰有 MWCNTs/Pt-nano 的电极的电流响应高于只修饰有 MWCNTs 的电极。修饰有 MWCNTs 的电极达到 95%信号的响应时间小于 15 s。传感器反应的线性范围是0.252.0 mmol/L; 灵敏度是 3.99 A/(mmol/L); 相关系数为 0.989; 检出限为 0.01 mmol/L（ S/N=3）。修饰有 MWCNTs/Pt-nano 的电极达到 95%信
19、号的响应时间小于 5 s。传感器反应的线性范围是 0.22.0 mmol/L; 灵敏度是 6.36 A/(mmol/L); 相关系数是 0.999; 检出限是0.3 mol/L（S/N=3）。上述结果表明：Pt-nano 能显著提高传感器的性能。图 5 MWCNTs/Ptnano/GCE(a)和 MWCNTs/GCE(b)修饰的传感器的电流随葡萄糖浓度的工作曲线及其线性相关点（略）Fig.5 Linear correlation points of Calibration plots and I-c curves for the MWCNTs/Ptnano/GCE(a) and MWCNTs/
20、GCE(b)0.1 mol/L PBS (pH 6.4) at 0.5 V vs.Ag/AgCl与其它基于 Sol-gel 的的方法构建的 L-乳酸传感器1618相对比，结果表明：本研究构建的L-乳酸传感器具有较大的响应电流、较低的检出限，表明 Pt-nano 结合 MWCNTs 提高了传感器的电化学性能。3.5 抗干扰性在干扰物各自生理浓度水平上考察了其对 L-乳酸响应的干扰。在 0.5 mmol/L L-乳酸溶液中，对其含有的对乙酰氨基酚（0.13 mmol/L）、葡萄糖（5.45 mmol/L）、尿酸（ 0.35 mmol/L）、抗坏血酸（0.055 mmol/L）、半胱氨酸（0.015
21、 mmol/L）进行检测(见表 1)。结果显示：对乙酰氨基酚、葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、半胱氨酸对L-乳酸的测定几乎没有影响。说明此传感器具有很好的抗干扰能力。原因是 MWCNTs/Sol-gel 修饰的玻璃碳电极降低了 H2O2 氧化还原过电位。表 1 L-乳酸检测中可能的其它底物的干扰(0.1 mol/L PBS pH 6.4) （略）Table 1 Possible interferences from other substrates for L-lactate determination (0.1 mol/L phosphate buffer at pH 6.4)电流比率(Curren
22、t ratio)=IL+I/II。其中 IL+I 和 IL 分别为干扰物存在和无干扰物的情况下 L-乳酸的响应电流(IL+I is the response current of L-lactate in the presence of interference.IL is the response current of L-lactate)。0.5 mmol/L L-乳酸(L-lactate).3.6 传感器的重复性和稳定性用同一传感器对 0.5 mmol/L L-乳酸溶液连续检测 5 次，相对标准差是 0.4%；用 5 个传感器对 0.5 mmol/L L-乳酸溶液进行检测，相对标准差是
23、2.0%。以上结果表明，构建的传感器具有很好的重复性。每隔 5 d 测定一次传感器对5 mmol/L 乳酸溶液的响应值。当传感器不用时，储存在 0.1 mol/L PBS 溶液（pH 6.8）中，室温放置。连续检测 4 星期以后，传感器的响应值仍保持在最大响应值的90%，表明此传感器具有很好的稳定性。3.7 人血样中 L-乳酸的临床检测在最适条件下，应用此传感器检测人血样中 L-乳酸，对其实际应用性能进行评估，并将其与分光光度法进行对比，结果见表2。表 2 两种方法对血样中 L-乳酸的检测（略）Table 2 Determination results of L-lactate in real serum using two methods对结果进行 t 校验： t0.09288； t0.05(11)= 1.7959； tt 0.05(11)， p0.05。由以上结果可以看出，两种方法测定结果无显著差异。本传感器对样品的测定结果与分光光度法具有很好的一致性。【
