1、 基于大鼠模型的蛛网膜下腔出血研究作者：赵炜疆，吴崇厚，刘乃友【摘要】 人们使用几种手段在大鼠上模拟蛛网膜下腔出血模型，以研究 SAH 后的病理生理改变、脑损伤和迟发性脑血管痉挛。然而到目前为止没有任何一个模型能够完全模拟临床上所观察到的全部现象。笔者通过回顾有关大鼠实验性蛛网膜下腔出血的研究性文献，对大鼠实验性蛛网膜下腔出血模型的致模方法、各方法涉及的研究内容和研究结论做以总结，从而对模型的适用范围做一简要评估，并从实验性大鼠 SAH 模型中建立起对 SAH 的深入认识。笔者对已经发表的大鼠蛛网膜下腔出血模型进行了系统回顾，相关文章来源于 Pubmed Medline 的检索系统，检索主题词
2、分别为“subarachnoid hemorrhage + rat”和“subarachnoid hemorrhage + rats”，共筛选出符合标准的文献 146 篇。笔者分别从致模方法和研究内容对这些文献进行了初步分析。结果表明应根据不同的实验需要选择与之相适应的大鼠模型。在一些情况下，应使用两种或多种大鼠蛛网膜下腔出血模型来阐明某些机制，从而达到最接近临床的结果，以期明确大鼠在实验性蛛网膜下腔出血研究中的重要作用。分析表明应根据不同的实验需要选择与之相适应的大鼠模型在一些情况下，应使用两种或多种大鼠蛛网膜下腔出血模型来阐明某些机制，从而达到最接近临床的结果。 【关键词】 大鼠；蛛网膜下
3、腔出血；枕大池注射；血管内穿刺；交叉前池注射Experimental subarachnoid hemorrhage in rats【Abstract】 Several means have been undertaken to simulate subarachnoid hemorrhage (SAH) in rats, in which pathophysiological changes, brain injury and vasospasm are investigated. However, no single means has been used to help interpre
4、t the whole phenomena observed clinically. By tracing back the published experimental data in rats, we endeavoured to come up with the optimal means corresponding to a certain clinical phenomenon. We performed a systematic review on published data about the SAH model in rats. Published articles were
5、 identified by searching Pubmed Medline. Assessment items were classified into Pathological evaluation; Vasospasm exploration; Behavioral investigation and survival; whether application in pharmaceutical filtration. Certain rat subarachnoid hemorrhage model should be purposefully selected according
6、to certain experimental design. In some special circumstances, two or more rat SAH model should be combined to interpret a complete mechanism to achieve a good result. Two or more rat models should be used to better our understanding of a phenomenon.【Key words】 Rat; subarachnoid hemorrhage (SAH); ci
7、sterna magna injection; endovascular puncture; prechiasmatic injection蛛网膜下腔出血引发的脑损伤已被关注多年，但 SAH 引发损伤的确切机制对基础和临床医学工作者来说仍是巨大的挑战，而动物模型则为我们探询这些机制提供了一个平台。在过去的半个世纪，人们在狒狒、猴、兔、犬以及大鼠上部分模拟了 SAH 发生中出现的各种现象15，为 SAH 发生机制提供了大量的数据。在所有实验动物中，大鼠模型因其性价比高、可相对准确的反应蛛网膜下腔出血而得到广泛认可。有三种发展比较成熟的大鼠 SAH 模型： （1）枕大池注血模型（cisterna
8、magna injection，CMI）; （2）血管内穿刺模型（endovascular puncture mod， EVP）; （3）交叉前池注血模型（prechiasmatic cisterna injection，PCI ）。它们广泛用于 SAH继发性脑损伤病理生理和组织病理方面以及脑大血管痉挛机制的观察和研究。然而由于大鼠与人在种属之间尚存巨大的差距，大鼠模型在反映 SAH 方面的重要性以及哪种模型更为优越都成为一个严峻的问题。鉴此，本文对近 15 年来 Pubmed Medline 上发表的有关大鼠 SAH 研究的文章进行一个小的回顾。1 方法1.1 文献查询及收选标准 入选文献均
9、为 1990 年2005 年 8 月Pubmed Medline 收录的已发表的有关实验性大鼠蛛网膜下腔出血的论文，搜索主题词为“subarachnoid hemorrhage/rat（s）”，限定于“title and abstract”。此外，其他限定还包括：（1） 使用自体或供体股动脉血进行枕大池注射，或使用血管内穿刺法致是模；（2）仅为单一的大鼠蛛网膜下腔出血研究，不涉及临床研究。1.2 相关模型的文献数量统计 分三个时间段：时间段 1：19901995 年；时间段 2：19961999 年；时间段 3：20002005 年。分别统计不同时间段使用不同模型的文献数量以及相关文献在全部文
10、献中的数量百分比。1.3 研究内容归纳 从模型制作方法、病理生理、损伤机制和血管痉挛发生机制角度进行归纳。1.4 结果总体评价 经检索共查到从 19902005 年 8 月符合条件的有关大鼠蛛网膜下腔出血三大模型的文献 146 篇。从 19901995年，有关 CMI、EVP 和 PCI 的文献数量分别为 29（90.63%）、2（6.25%）和 1（3.13%）；从 19961999 年，相关文献数量则为36（80% ）、9（20%）和 1（2.23% ），其中有关 PCI 的文献同时使用了 CMI 法；而从 20002005 年 8 月相关文献数量则变为36（51.43%）、31（44.2
11、9%）和 5（7.14%），其中 PCI 与 CMI 联合应用的文献有 2 篇。2 模型制作方法大鼠枕大池自体股动脉血注射法是自股动脉抽取自体血后，通过注射器或导管经寰枕筋膜将血液引入到枕大池，并通过将大鼠头部倾斜一定角度令血液在蛛网膜下腔扩布的方法。注血量范围0.070.5ml68，有先抽出一定脑脊液，然后注射，有直接注射，注射速度从 30s10min 不等。肉眼观察血液广泛分布于大鼠脑组织颞叶底面，Willis 环周围，额叶中线，小脑各脑叶间，脑干前后部，我们通过 HE 染色尚观察到血液可通过第四脑室进入到第三脑室和侧脑室。此外，为了使 SAH 后脑血管痉挛更接近人类的双时相特点，人们在单
12、次枕大池自体血注射的基础上又复制了大鼠二次枕大池自体股动脉血注射法，即在首次注血 24h 或 48h 再行自体血枕大池注射，并将脑血管痉挛的观察时间延长到 SAH 7 天。Fig 1. Numbers of references about three widely recognized experimental models in rats embodied by medline from 1990 to August 2005, which are divided into 3 stages:stage1 1990-1995; stage 2 1996-1999; and stage 3
13、2000-August 2005.CM cisterna magna injection, EV endovascular puncture, and PC prechiasmatic injection.血管内穿刺法也称谢菲尔德模型（Sheffield model），与大鼠大脑中动脉线栓法类似，即将尼龙线通过颈外动脉，自颈内动脉导入大脑中动脉和前动脉交叉处并通过将线进一步向前推进 23mm 刺破交叉处，然后退出线至颈外动脉处，血液在压力作用下涌入蛛网膜下腔，广泛分布于大脑半球基底、凸面以及半球间蛛网膜下腔和整个脑室系统9，10。该方法可引起血管损伤和颅内压突然升高，较好模拟动脉瘤破裂所引起的
14、蛛网膜下腔出血情况，且脑组织损伤严重，神经功能缺损症状明确，但 24h 内死亡率较高（50%）10，且由于每只大鼠损伤程度不一，CBF 下降程度及死亡率亦有差异。视交叉前池注射法是将注射器通过视神经孔插入到视交叉前池将抽自股动脉或腋动脉的血液注入蛛网膜下腔，使其在蛛网膜下腔分布的方法。使用此方法注射动脉血 0.3ml，死亡率为 50%11。3 病理生理水平研究3.1 脑血流 脑血流是蛛网膜下腔出血后超早期改变的病理生理指标，也是评价药物疗效的重要指标之一。CPP 是指平均动脉压与颅内压的差值，Bederson10在大鼠 EVP 模型中研究 CPP（脑灌注压）与 CBF 之间的关系，发现 SAH
15、 60s 内 CPP 逐渐下降并达到最低点，然后开始升高，而 CBF 仍持续走低，并晚于 CPP 达到其最低点，且两者峰值变化不存在相关性。上述发现表明尽管 SAH 后CPP 的下降引起皮层脑血流的最初下降，但 CPP 降至谷底后其他因素如急性血管收缩则继续参与到 CBF 下降中来10。脑血流测定的方法有放射性微球法、氢清除率法以及激光多普勒法。Kehl 等11发现枕大池注血 0.3ml，10min 时 CBF 下降至正常值 30%，并低水平持续 2h，而预先给予阻断 20-HETE 形成的 17-ODYA 和HET0016 可使 CBF 下降的程度降低 40%，并使血流于 SAH 诱导 1h
16、后完全恢复。Prunell12分别采用枕大池、血管内穿刺法和前交叉池注血法对 CBF 进行观察 ,后者 CBF 于注血后均下降到 35%。在枕大池注血中 SAH 15min 内 CBF 逐渐升高，并回复至正常水平，不利于对SAH 急性期进行研究。而血管内穿刺法、视交叉前池注血法中 CBF在 SAH 90min 时可维持在正常值 60%和 89%的水平。枕大池注血法对研究 SAH 晚期具有一定的价值。Critchley GR 和 Zausinger 13，14采用 EVP 法发现蛛网膜下腔出血后 ICP 升高达（ 53.09.8）mmHg，且与脑血流下降相关，组织氧化水平也下降至正常值的（42.
17、87.7 ） %。Clozel15采用放射性微球法进行 rCBF 监测发现，枕大池注血 0.3ml 可引起脑血流下降 22%38%，而经枕大池给予选择性 ETA 受体拮抗剂五肽 BQ-123 可完全抑制 SAH 60120min 时 rCBF 的下降。Sun 等16在EVP 模型中亦发现 SAH 可引起急性 CBF 下降，伴有 ET-1 活性明显升高并持续 24h。Naveri17使用激光多普勒血流仪发现，SAH 20min 时静脉给予血管紧张素 （angiotensin ， ANG ）可在SAH 60min 时使 CBF 从 45%升高到 84%。 Yamamoto18使用示踪剂 15O-H
18、2O 进行正电子发射断层扫描发现枕大池注血可明显引起额顶及枕叶 CBF 下降，而预防性给予 AVS(+/-)-N,N-propylenedinicotinamide可改善 CBF。这些提示 SAH 后脑血流下降与内皮素、血管紧张素、羟自由基以及 Ca2+通道激活关系密切。此外血流持续保持在基线 30%水平与炎症反应明显相关，且TUNEL 阳性区域与炎症反应高度吻合。Nestin、ED1、OX6 以及细胞间粘附因子和肿瘤坏死因子呈免疫强阳性，以靠近外溢血液的脑组织反应为著19。Prunell 等20使用 EVP 法研究表明急性CBF 下降与继发性细胞死亡的程度有关，提示凋亡样通路的相关性，表明存
19、在一个治疗时间窗以便有充分的治疗来减少 SAH 造成的最终损伤。3.2 颅内压、脑组织水含量、血脑屏障 血脑屏障的完整性对于保持神经系统环境的恒定是十分重要的。许多神经系统疾病可引起血脑屏障的改变，包括高血压、梗死、脑创伤和颅内压突然增高21。German 在 CMI 大鼠模型中应用 14C 标记的 氨基异丁酸定量技术研究表明 SAH 可引起明确的蛛网膜下腔出血破坏 22，并指出控制改善 BBB 对治疗蛛网膜下腔出血病人具有一定的临床价值，此后 German 使用伊文思蓝外渗定量法研究发现使用 calpain 抑制剂可改善 BBB，提高 SAH 大鼠的行为学表现23。随后 Gules在 CM
20、二次注血模型中研究发现 SAH 7 天大鼠 BBB 通透性出现改变，并与微血管内皮细胞凋亡一致24。实验性蛛网膜下腔出血增加颅内压、BBB 通透性和脑水肿并引起较高死亡率。SAH 可诱导大脑动脉 VEGF 和 MAPKs 的磷酸化，其次是大脑皮质。而 Src 家族蛋白酶抑制剂 PP1 可减少 BBB 通透性、脑水肿和死亡率并减少 VEGF 和 MAPKs 的磷酸化25。3.3 脑损伤机制研究 近年来，随着人们对凋亡机制的深入了解和认识，以及临床病理解剖研究中对有关凋亡证据的发现，人们逐渐明确了凋亡是蛛网膜下腔出血后脑损伤的机制之一26，27，人们开始关注使用大鼠 SAH 模型来研究 SAH 后
21、脑组织凋亡及其可能涉及的相关信号转导通路。Prunell 20使用 EVP 及 PCI 两种方法对 SAH 后组织损伤的凋亡机制进行了研究。结果表明有 1/32/3 存活的大鼠于 SAH 2 和 7 天后脑片 TUNEL 染色显示 DNA 断裂。80%以上 TUNEL 阳性细胞为神经元，大多数 TUNEL 阳性细胞表现为染色质浓缩和/或发疱且 Bax 免疫染色增强。 50%的 TUNEL 染色阳性神经元活性 Caspase-3 染色阳性,少数 Bcl-2 染色阳性。急性脑血流降至 30%以下的持续时间与 TUNEL 染色的程度有关，表明 SAH 可在很大程度上引起迟发性细胞死亡,但并不是全部存
22、活动物。急性 CBF下降与继发细胞死亡的程度相关，提示类凋亡样通路与 SAH 有关，且存在一个时间治疗窗以便采取充分的治疗来降低 SAH 后的最终损害。 Park 等27在 EVP 模型中研究发现凋亡大多数情况下出现于大脑内皮细胞,部分出现于海马神经元,还有较少量出现于大脑皮质,相应的也可观察到 BBB 通透性和脑水含量的增加,同时伴有 SAH 24h后神经损伤及高死亡率。分别于 SAH 前 1h 和 SAH 后 6h 腹腔内给予广谱 Caspase 抑制剂 z-VAD-FMK,可抑制内皮细胞 TUNEL,降低caspase-3 的活性,BBB 通透性,缓解血管痉挛 ,抑制脑水肿和改善神经系统
23、症状。此外,SAH 后海马及皮质细胞出现凋亡形态学改变伴有HIF-1、VEGF 和 BNIP3 免疫染色增强10,这些都提示 SAH 后继发性脑损伤神经元凋亡是多信号分子参与的高度复杂的调控体系。3.4 脑血管痉挛研究 自蛛网膜下腔出血可引起脑血管痉挛之后，人们首先开始关注 SAH 后脑血管痉挛的时相规律研究。应用的方法有动脉管径直接测量法、血管造影法等。早期的血管痉挛观察为直视下血管管径测量28，或通过脑血流量来反映29，后来逐渐发展了血管造影术30以及脑灌注压测量技术9，31。动脉血管造影是研究蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛时相变化规律的重要方法之一，是实时反映脑动脉血管管径的重要手段。枕大池
24、注血法由于保留了颅内动脉的完整性，因此形成封闭的管道系统以便使造影剂进入颅内循环的任一分支：进入大脑中动脉、大脑前动脉则形成前循环造影；顺行或逆行进入基底和椎动脉则实现了椎基底动脉造影。造影剂入路有两条途径：经腋动脉逆行插管止于椎动脉起始部然后注入造影剂，造影剂经此顺行经过椎动脉、基底动脉，实现后循环造影30；经颈总动脉、颈内动脉注入造影剂，可同时实现前后循环显影32，亦有经颈总动脉逆行入路进行椎基底动脉造影33，但前循环由于颅骨骨影干扰过多往往得不到很好显示，故使用数字减影是较好的选择，该方法仍可获得很好的后循环显影图像。在体颅内大鼠血管痉挛模型痉挛观察见表 1。 表 1 在体颅内大鼠血管痉
25、挛模型痉挛观察3.5 脑血管痉挛机制的研究 动脉瘤破裂性 SAH 后可首先出现短暂的 CVS，而后 CVS 再次发生并于出血 410 天达到高峰34。CVS 时血管平滑肌异常收缩，形态学上表现为平滑肌细胞收缩和营养不良，内皮细胞也出现营养不良表现，细胞之间以及细胞与基底层之间失去紧密连接，导致部分细胞脱落，一些细胞的胞浆固缩、膜发疱、染色质凝集，出现典型的凋亡表现35。血管平滑肌胞浆中 Ca2+浓度异常升高导致肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化增强是CVS 时平滑肌收缩的关键环节，最近在大鼠蛛网膜下腔出血的研究证明其他信号传导通路也参与了血管痉挛过程，可通过不依赖 Ca2+的方式参与血管平滑肌细胞异
26、常收缩，在 CVS 的发病机制中发挥重要作用。使用枕大池二次股动脉血注射大鼠 SAH 模型的研究表明，注血3、5 和 7 天后光镜和透射电镜可观察到动脉弹力层皱缩以及平滑肌细胞收缩，反转录 PCR（RT-PCR ）显示 Rho 激酶 和 mRNA 可在基底动脉中表达并明显上调，于 SAH5 天时达到高峰 36。Park 等 27在 EVP 模型中研究发现基底动脉内皮细胞凋亡，而经腹腔内给予广谱 Caspase 抑制剂 z-VAD-FMK,可抑制血管内皮细胞TUNEL 和活性 caspase-3 的表达,缓解血管痉挛。 Kusaka 等37在EVP 大鼠模型的研究表明 SAH 可诱导血管内皮生长
27、因子 (VEGF)和有丝分裂源激活蛋白激酶 K（MAPK）的磷酸化，可被 Src 家族激酶抑制剂 PP1 降低。4 讨论从模型数量上看，PCI 法在三个时间段的使用数量均比较低，提示该方法在 SAH 脑损伤和脑血管痉挛病理生理机制研究中尚存在一定的局限性，其价值有待明确。而 CMI 法在各时间段所占的比重均比较高，表明该方法在反映 SAH 发病机制和药物干预方面是比较全面和理想的模型。近 10 年来，EVP 法日益受到关注，应用该模型的文献数量也逐年增多，该方法尤其在继发性脑损伤方面有其独特的优势：出血压力与临床接近，脑损伤比较严重而明确，但损伤的稳定性较 CMI 法差，且死亡率高，也不适合血
28、管痉挛的造影观察。通过对十几年来有关实验性大鼠蛛网膜下腔出血的实验研究的文献的综合分析，可以明确 SAH 是一个复杂综合的全脑性的病理损伤过程，涉及大脑大动脉、大脑微动脉以及各大脑区域脑神经元。蛛网膜下腔出血不仅造成实质性改变，也可造成一系列的神经功能和行为损伤。综合各方面实验性大鼠蛛网膜下腔出血的实验研究不难看出，蛛网膜下腔出血实验研究涉及到复杂的病理生理机制。一方面血液进入蛛网膜下腔引起一过性颅内压增高，脑关注压降低、脑血流量减少，造成一定程度脑缺血，而另一方面血液中的氧合血红蛋白可直接造成脑实质损伤并可引起迟发性脑血管痉挛，进一步加重缺血性脑损伤。因此如何进一步明确蛛网膜下腔出血后脑损伤和脑血管痉挛机制还有待通过各种蛛网膜下腔出血模型对其进行进一步深入研究。综上所述，结合各种模型对 SAH 某一机制进行研究是未来大鼠 SAH 模型应用上的一个合理选择。【
