1、 基于 26S rDNA D1D3 区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别作者：安冉,杨锦芬,刘军民,翟明,徐鸿华【摘要】 【目的】利用 26S rDNA D1D3 区序列差异鉴别鸡血藤及其混淆品。【方法】使用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取鸡血藤及其混淆品的总 DNA,选择浓度较高的样品作为模板DNA,对 26S rDNA D1D3 区进行 PCR 扩增、测序和序列比对分析。【结果】获得 26S rDNA D1D3 区长约 700 bp 的序列。比对结果显示,不同产地之间鸡血藤的序列一致率为 96%和 100%,混淆品与正品比较的序列一致率为 80%96%。在 26S rDNA D
2、1D3 区384472 bp 的位置有足够的碱基差异位点用以区分鸡血藤及其混淆品。【结论】26S rDNA D1D3 区序列可以应用于鉴别鸡血藤及其混淆品。 【关键词】 鸡血藤;序列分析，DNA鸡血藤为豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎,其性温,味苦、甘, 归肝、肾经, 有补血、活血、通络的功效, 用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症1。商品鸡血藤药材基源植物除中国药典收载的密花豆外,还有豆科、五味子科、木通科等共 6 个属 15 种和变种的植物,如常春油麻藤、香花崖豆藤等2。由于商品鸡血藤的来源复杂,临床中常出现混用现象。目前,对鸡血藤类药材
3、的鉴别,多以传统鉴别方法为主,但这不足以简便、准确地鉴别其真伪。植物基因的 26S rDNA D1D3 区中包含一个序列变异快的D2 区可用于鉴别不同的植物,两端又有保守区域可供设计通用 PCR引物,且该区域具有长短适宜,便于扩增、测序和比对的特点3,因此,本研究选用 26S rDNA D1D3 区对鸡血藤及其混淆品进行 DNA 序列分析,旨在为鸡血藤种质评价与鉴定提供分子鉴别的依据,现报道如下。1 材料与方法11 药材实验所用的鸡血藤及其混淆品(见表 1)采自我国鸡血藤主产区：广东、广西省区的野外及广州中医药大学三元里药圃,经广州中医药大学徐鸿华教授鉴定并确定其拉丁学名。分别采集幼嫩叶片,装
4、于密封塑料袋内,用变色硅胶干燥,置于-20冰箱保存,备用。表 1 鸡血藤及其混淆品的产地来源12 试剂及仪器 Tris 购自 Salandchem International Inc,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 均购自上海伯奥生物技术公司,乙二胺四乙酸(EDTA)购自天津福晨化学试剂厂,PCR试剂、DNA marker 购自大连宝生物技术公司,PCR 产物纯化试剂盒购自北京赛百盛基因技术公司,引物由上海生工生物工程技术公司合成,PTC 200 型 PCR 仪(美国 Biorad 公司),DYCP31 水平电泳仪(北京六一仪器厂),Infinity 1000/26
5、M 凝胶成像及分析系统(法国Vilber Lourmat 公司)。13 总 DNA 的提取采用 CTAB 法4并加以改良。取 01 g样品,用灭菌纯水把叶片冲洗干净,吸水纸吸去表面水分。加 800 L CTAB 提取液,石英砂适量。冰浴快速研磨 1 min,转入 2 mL 离心管。65温浴 2040 min,间或轻摇离心管。将离心管取出,冷却至室温,加入等体积的氯仿异戊醇(体积比 241)。将离心管上下颠倒几次,充分混匀,10 000 r/min 离心 15 min。吸取上清液 400 L,加入等体积的氯仿异戊醇重复抽提 1 次,离心。取上清液 300 L,加 07 倍体积的冰冻异丙醇,缓缓平
6、转离心管,可见白色的 DNA 絮状物,4冰箱放置 20 min2 h。10 000 r/min 离心 15 min,弃上清液。用体积分数 70%乙醇 1 000 L 清洗沉淀 2 次,10 000 r/min 离心 5 min,倒出乙醇。沉淀室温风干后,加 150 L 灭菌纯水溶解,-20 保存，用 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量。14PCR 扩增及产物测序引物选用 DUAN5(5TAGTAACGGCGAGCGAAC3) 、DUAN6(5 GGCATAGTTCACCATCTTTC3)3 分别做为上下游引物扩增 26S rDNA D1D3 区。PCR 反应总体积 50 L,含
7、ExPCR buffer 5 L,三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)3 75 L,DUAN5、DUAN6 各125 L,Ex Taq 酶 05 L,模板 DNA 15 L(约 50 ng),灭菌水补足 50 L。扩增程序为：94 预变性 2 min 后进入循环,94 变性 30 s,60 复性 30 s,72 延伸 1 min,循环 29 次;72 延伸 5 min,4 保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的片段,送广州英骏生物技术公司用上下游引物进行双向测序。15 序列的同源性比对及提交ncbinlm nihgov/Blastcgi,对测序所得序列进行BLASTN(Nucleoti
8、de BLAST)同源搜索,确定所获序列是否为 26S rDNA 基因序列。使用 Sequin 软件向 GenBank 提交所测得的 7 个样品序列,获得序列登记号。16 序列分析采用 BLASTN 的两序列比对功能(Align two sequences using BLAST),以鸡血藤样品 1 的 26S rDNA D1D3 序列为标准序列,分别与之比对获得序列之间的一致率。用 DNAMAN 软件对 7 个样品的序列进行多重比对,寻找差异位点,并构建系统发生树。2 结果与分析21 总 DNA 的提取如图 1 所示,从叶片中提取到的 7 个样品的总 DNA 浓度约为 3050 ng /L
9、。1鸡血藤 1;2鸡血藤 2;3鸡血藤 3;4香花崖豆藤;5常春油麻藤;6厚果鸡血藤;7鱼藤;8DNA Marker(250 bp DNA Ladder)图 1 总 DNA 电泳图Figure 1Electrophoregram of total DNA of CaulisSpatholobi and its adulterants2226S rDNA D1D3 区扩增结果如图 2 所示,7 个样品 PCR扩增后均得到长度约为 750 bp 的清晰片段,与预期的 26S rDNA D1D3 区 700800 bp 的片段大小基本相符。1鸡血藤 1;2鸡血藤 2;3鸡血藤 3;4香花崖豆藤;5常
10、春油麻藤;6厚果鸡血藤;7鱼藤;8DNA Marker(250 bp DNA Ladder)图 2PCR 产物Figure 2PCR products of Caulis Spatholobi and its adulterants23 序列分析对各样品的 PCR 产物测序结果进行处理,得到鸡血藤及其混淆品的以“TTAGTTA”为始端和以“TGTG(A)AAGG”为末端的 698707 bp 序列。对所得的 7 个样品序列进行 BLASTN 同源性搜索,结果显示,与已知的大豆 Glycine max Merrill的 26S rDNA部分序列(GenBank 登记号：AY935814) 均有较
11、高的序列一致性 (见表2),其中最高达 97%,证明本实验扩增获得的序列为 26S rDNA 的部分序列。向 GenBank 提交鸡血藤及其混淆品的 7 个 26S rDNA 部分序列,获得相应的序列登记号(见表 3)。以鸡血藤样品 1 的 26S rDNA D1D3 区序列作为标准序列,其他序列与之比对的结果显示,不同产地鸡血藤之间的序列一致率为96%或 100%,4 种混淆品与正品鸡血藤的序列一致率为80% 96%(见表 2)。7 个样品序列多重比对的结果检测到较多的碱基差异位点,其中差异位点较集中的区域位于 384472 bp(见表 3),这些差异位点足以区分鸡血藤正品及其混淆品。表 2
12、 序列比对表 3 基因差异位点24 亲缘关系分析以 7 个样品的 26S rDNA D1D3 区序列构建系统发育树,结果如图 3 所示。厚果鸡血藤与不同属的常春油麻藤的亲缘关系较近,而与同属植物香花崖豆藤的亲缘关系反而较远。不同产地鸡血藤之间的遗传距离明显小于鸡血藤与混淆品之间的遗传距离,即属内(密花豆属)遗传距离明显小于属间(密花豆属与崖豆藤属、黧豆属、鱼藤属)遗传距离。图 3 基于 26S rDNA D1D3 区构建的系统发育树3 讨论Kuzoff 等5的研究表明,26S rDNA 序列存在 D1D12 共 12个高变异的扩展区可用于鉴别不同的植物,扩展区的两端又存在变异较慢的保守区域可供
13、设计通用 PCR 引物。本研究选用 26S rDNA 序列中最具有代表性的 26S rDNA D1D3 区域,尝试运用 26S rDNA D1D3 区的序列分析从分子角度建立一种可以准确、快速地鉴别鸡血藤及其混淆品的方法。本研究结果显示鸡血藤及其混淆品在 26S rDNA D1D3 区域的碱基序列具有较高的保守性(正品鸡血藤与混淆品的序列一致率高达 80%96%)的同时,又存在较多的碱基差异位点,特别是在384472 bp 的区域(D2 区)内存在足够的差异位点可区分不同种属的样品。表明不同产地鸡血藤之间的变异性小于鸡血藤与其混淆品之间的变异性,即种内变异性小于种间变异性,借此可以区分鸡血藤与其混淆品。由于本研究材料的采集还不够广泛,加上物种本身的遗传多样性,这可能是造成系统发育树中表现的亲缘关系与传统分类法不完全一致(本文系统发育树显示,厚果鸡血藤与不同属的常春油麻藤的亲缘关系较近,而与同属植物香花崖豆藤的亲缘关系反而较远)的原因。(致谢：本研究获得广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺教授和黄琼林研究生的大力支持和帮助,特此致谢!)【
